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蜗牛061610

木虫 (小有名气)

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[求助] 将质粒上紧挨着的两个酶切位点进行双酶切后连接外源基因片段，是不是不好连接？

有人说如果质粒上两个切点紧挨着的话，双酶切容易切错。我就先用一个酶进行酶切，切完后过pcr纯化试剂盒后用第二个酶进行酶切，再过pcr纯化试剂盒进行酶连。酶连了两批，挑去转化子抽取质粒进行pcr鉴定都是假阳性，搞不清楚是什么原因。

[ 来自科研家族化学生物学 ]

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1楼2011-10-09 14:13:32

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xiangli2007

新虫 (初入文坛)

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引用回帖:

10楼: Originally posted by erlangshen89 at 2013-08-09 10:56:29
不同顺序酶切的话还用先回收再用另一个酶切还是直接再加入另一个酶？

如果两个酶可以用相同的buffer，就第一个酶切三小时后直接加入第二个酶，刚刚用这种方法做出来了，也是紧挨着的位点

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12楼2014-01-26 07:48:23

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amilie030312

金虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2): 鼓励应助发帖！ 2011-10-09 20:19:42
蜗牛061610(金币+2): 谢谢交流 2011-10-10 08:29:41

两个酶切位点挨的近那是有多近啊？质粒要计算保护碱基的话要计算保护碱基对不是保护碱基个数，如果保护碱基不够酶切就没办法切好，我有疑问的是你为啥每次酶切完了都要回收一下，质粒损失多大啊。另外，连接如果连接不上看是否是酶切的末端有平也有粘，这样不太好连的，最好两边都是4碱基突出的粘端是最好连的。至于假阳性，出现这个结果的可能性还真不是一句两句说得清的，一个问题一个问题排除吧。

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2楼2011-10-09 14:30:25

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