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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 细菌RNA的提取
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陈浩南-1987

铁虫 (正式写手)

[求助] 细菌RNA的提取

本人想用RT-PCR做细菌的基因表达，请问有没有做过细菌RNA提取的？
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1楼 2011-09-26 15:57:27
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yemuren

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
rainwander(金币+2): 鼓励交流 2011-09-26 17:48:06
首先你要注意要在细菌有转录你的目的基因最高峰的时候收集菌体，迅速冷冻，这样获得的RNA中你目的基因的丰度更高；至于RNA的提取，参照真菌的RNA提取方法就可以了一般用Trizol试剂提取，也有用试剂盒提取的，主要还是要注意所有用具都要去除RNase，使用新的有机溶剂异丙醇氯仿等，提取过程迅速就可以了。
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我的专长叫做流浪，所以我就做了流氓~
2楼2011-09-26 16:16:26
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zhymhbu

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yemuren at 2011-09-26 16:16:26:
首先你要注意要在细菌有转录你的目的基因最高峰的时候收集菌体，迅速冷冻，这样获得的RNA中你目的基因的丰度更高；至于RNA的提取，参照真菌的RNA提取方法就可以了一般用Trizol试剂提取，也有用试剂盒提取的，主要 ...

冷冻是指冰箱-20度，还是指液氮冷冻。保存多长时间可以

此外，楼主是做半定量PCR吗
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微生物学-发酵工程-生化工程-生化与分子生物学-环境毒理学
3楼2011-09-26 17:07:20
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yemuren

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
rainwander(金币+1): 鼓励交流 2011-09-27 10:38:27
引用回帖:
3楼: Originally posted by zhymhbu at 2011-09-26 17:07:20:
冷冻是指冰箱-20度，还是指液氮冷冻。保存多长时间可以

此外，楼主是做半定量PCR吗

液氮冷冻，最好是直接液氮研磨，如果没准备好其他的东西的话，先也氮冷冻，然后放到-80冰箱里。保存时间多久没试过，我一般都是直接提，最多的时候放了两天。
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我的专长叫做流浪，所以我就做了流氓~
4楼2011-09-26 19:41:01
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陈浩南-1987

铁虫 (正式写手)
大家没有把握住要点，细菌是原核，跟真核的不一样，转录不一样，而且没有polyA尾巴，我就想问问这点如何解决
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5楼2011-09-27 21:40:16
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雅yakee

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

怎么知道什么时候是我目的基因最高峰的时候呢？
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6楼2012-09-25 15:44:28
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ben1147

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
1929148楼: Originally posted by 陈浩南-1987 at 2011-09-27 21:40:16
大家没有把握住要点，细菌是原核，跟真核的不一样，转录不一样，而且没有polyA尾巴，我就想问问这点如何解决

这点很好解决啊，RT的时候用基因特异引物或者随机引物就行了么。又不是非得用oligo(dT)
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7楼2012-09-25 22:27:27
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
1929148楼: Originally posted by 陈浩南-1987 at 2011-09-27 21:40:16
大家没有把握住要点，细菌是原核，跟真核的不一样，转录不一样，而且没有polyA尾巴，我就想问问这点如何解决

先提总RNA，反转录时不用oligo dT引物，可以用随机引物或者基因特异引物。如果你的目的基因的丰度不是很低的话，用随机引物比较好，这样合成的cDNA可以想做什么基因就做，方便比较。
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8楼2012-09-26 10:16:47
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