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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 自噬检测方面的问题
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zdx0

木虫 (小有名气)

[求助] 自噬检测方面的问题

大家好！我刚刚开始自噬方面的实验，请教大家：
我用不同浓度的药物，定性和定量检测24h时-Hela细胞自噬发生情况。根据文献的查阅情况，开始应用MDC染色在荧光显微镜下观察；另一方面用流式细胞仪定量检测MDC阳性比例。问题是：
1、最初两次荧光显微镜下检测，和对照组相比，给药组的荧光现象更明显，可是最近做总是看到一片淡绿色，看不到每个细胞的轮廓及荧光情况？
2、流式检测时，阳性Rapamycin对照总是不好，有时甚至和阴性图形类似？

我的怀疑是:
1、MDC染色方法操作处理中的问题。国内一些文献使用的方法不一，吖啶橙染的也不少。MDC有的用爬片，有的没用，具体写的不够详细。我没有使用爬片，给药24h后，PBS清洗，用MDC六孔板内染色孵育15min后直接进行的荧光镜检。因为前两次有比较明显的图，这样操作过程简单，觉得可以。可是，最近却观察不到了，而且流式的结果图，阳性总是不明显。
2、试剂。我按照文献和说明书处理的MDC和Rapamycin，终浓度0.05mmol/L和1umol/L，试剂使用前一天配置。
3、仪器。
4、操作。流式上机之前，MDC孵育后处理就是清洗，消化，离心（2次），重悬，上机。

开始觉得挺简单的，荧光检测比较明显，就做了流式看看，但阳性参照却不明显，很纳闷。大家觉得是怎么回事，有什么建议么？
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科研是长远的
1楼 2011-09-26 15:32:07
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zdx0

木虫 (小有名气)
引用回帖:
4676034楼: Originally posted by wywangying169 at 2012-09-06 14:45:57
楼主，您好，能不能够发一下MDC使用的参考文献给我，我想知道一下MDC怎么配制及使用。
能用于切片吗？...

文献很多。英文文献和国内关于自噬方面的操作方法大同小异，建议找一篇中文直接参考。

MDC可用DMSO溶解，配成高浓度储存，现用再稀释。（可参考部分中文文献）
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科研是长远的
9楼2012-09-06 20:33:59
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zdx0

木虫 (小有名气)
没人？
我再重复看看...注意下操作和避光...
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科研是长远的
2楼2011-09-29 14:40:00
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vetzhangshen

铁虫 (初入文坛)
应该去其他版面问问去
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3楼2012-02-14 09:13:49
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zdx0

木虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by vetzhangshen at 2012-02-14 09:13:49:
应该去其他版面问问去

这问题我已经有一定的答案了
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科研是长远的
4楼2012-02-14 12:14:25
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