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zdx0木虫 (小有名气)
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自噬检测方面的问题
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大家好！我刚刚开始自噬方面的实验，请教大家： 我用不同浓度的药物，定性和定量检测24h时-Hela细胞自噬发生情况。根据文献的查阅情况，开始应用MDC染色在荧光显微镜下观察；另一方面用流式细胞仪定量检测MDC阳性比例。问题是： 1、最初两次荧光显微镜下检测，和对照组相比，给药组的荧光现象更明显，可是最近做总是看到一片淡绿色，看不到每个细胞的轮廓及荧光情况？ 2、流式检测时，阳性Rapamycin对照总是不好，有时甚至和阴性图形类似？ 我的怀疑是: 1、MDC染色方法操作处理中的问题。国内一些文献使用的方法不一，吖啶橙染的也不少。MDC有的用爬片，有的没用，具体写的不够详细。我没有使用爬片，给药24h后，PBS清洗，用MDC六孔板内染色孵育15min后直接进行的荧光镜检。因为前两次有比较明显的图，这样操作过程简单，觉得可以。可是，最近却观察不到了，而且流式的结果图，阳性总是不明显。 2、试剂。我按照文献和说明书处理的MDC和Rapamycin，终浓度0.05mmol/L和1umol/L，试剂使用前一天配置。 3、仪器。 4、操作。流式上机之前，MDC孵育后处理就是清洗，消化，离心（2次），重悬，上机。 开始觉得挺简单的，荧光检测比较明显，就做了流式看看，但阳性参照却不明显，很纳闷。大家觉得是怎么回事，有什么建议么？ |
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