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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 蛋白纯化问题
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C-JingX

金虫 (小有名气)

[求助] 蛋白纯化问题

求助：包涵体纯化，方法是镍柱亲和层析，问题是每次蛋白都在洗杂蛋白时被洗下来，尝试了很多方法，不知道怎么优化？还有个疑问是，组氨酸只有6个，但目的蛋白有100多KDa，会不会是因为蛋白太大，6个组氨酸与镍柱的亲和力无法承受这么大蛋白，就像常用的粘钩一样，挂太重的东西就会直接掉下来呢？？？
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1楼 2011-09-25 11:19:11
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zhengli123

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
wanhscn(金币+3): 鼓励新虫友回帖参加交流! 2011-12-22 21:04:39
挂柱可能是蛋白在折叠过程中his标签被折叠到蛋白内部，
检查一下缓冲液的成分，比方说一定不能有EDTA等
如果都不是，那建议楼主换标签吧，GST的，实在不行，就在真核生物中表达吧
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12楼2011-12-22 20:55:46
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aayqaa

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

C-JingX(金币+1): 如果是不能结合的话，那上样的时候就应该直接流出来了啊，怎么还会在杂蛋白里面呢？？ 2011-09-26 10:01:45
组氨酸部分可能碰巧被包裹在了蛋白的内部导致无法结合
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2楼2011-09-25 19:32:18
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丙氨酸密码子

新虫 (小有名气)
★
wanhscn(金币+1): 鼓励交流 2011-09-26 22:59:53
我现在还没做到这一步呢，哎，，我还在艰难的徘徊在PCR上面，提RNA，RT-PCR啊，，， 郁闷啊。
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3楼2011-09-25 19:48:32
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)
★ ★
wanhscn(金币+2): 鼓励交流! 2011-09-26 23:00:14
已经也碰到过几个蛋白是这种情况，无解。
你可以试试变性后纯化或复性后纯化，看有没有区别。
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VX：19192310212；公众号：生物技术与IVD
4楼2011-09-25 19:54:40
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