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lingonghua

铁杆木虫 (正式写手)

★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
dhd997(金币+2): 鼓励交流 2011-09-20 08:00:25
引物有没有问题?
我这两天做PCR,开始能扩出来,后来优化完善体系的时候反而扩不出来了。然后把原先备份的引物粉末重新溶解稀释,就又能扩出来了。

另一个是dNTP,我的40微升体系,一开始用4微升扩不出来,减到2微升反而能扩出来。
31楼2011-09-18 17:40:32
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老夏853

铁杆木虫 (著名写手)

引用回帖:
31楼: Originally posted by lingonghua at 2011-09-18 17:40:32:
引物有没有问题?
我这两天做PCR,开始能扩出来,后来优化完善体系的时候反而扩不出来了。然后把原先备份的引物粉末重新溶解稀释,就又能扩出来了。

另一个是dNTP,我的40微升体系,一开始用4微升扩不出来,减 ...

这个 引物我当初合成的时候2OD 分装两管 发现做不出来的时候 我另一管也用了 依然做不出来
你说那个DNTP,我们用的是混合好的mix  里面的dntp 各是0.4mM  ~~
32楼2011-09-18 20:29:59
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jinkui960

至尊木虫 (知名作家)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
感觉象是DNA的模板浓度太高,稀释模板试试,祝好运!
33楼2011-09-19 09:08:36
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老夏853

铁杆木虫 (著名写手)

引用回帖:
33楼: Originally posted by jinkui960 at 2011-09-19 09:08:36:
感觉象是DNA的模板浓度太高,稀释模板试试,祝好运!

恩 老师 您好
我现在已经稀释过 10,20,50.100倍,效果时一样的
34楼2011-09-19 10:09:24
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jinkui960

至尊木虫 (知名作家)

★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
dhd997(金币+2): good 2011-09-20 08:00:43
引用回帖:
34楼: Originally posted by 老夏853 at 2011-09-19 10:09:24:
恩 老师 您好
我现在已经稀释过 10,20,50.100倍,效果时一样的

建议换用其他同学的PCR扩增体系,包括去离子水,dNTP,如果还不行的话可能就是模板的问题,重新提模板试试!
35楼2011-09-19 12:57:16
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老夏853

铁杆木虫 (著名写手)

引用回帖:
35楼: Originally posted by jinkui960 at 2011-09-19 12:57:16:
建议换用其他同学的PCR扩增体系,包括去离子水,dNTP,如果还不行的话可能就是模板的问题,重新提模板试试!

恩 谢谢老师
我们用的是混合的extaq 酶  takara 的  
水是我问养细胞的同学要的超纯水,
再就是加的 BSA 作为保护剂
东西都换过  也重新提过模板
我现在 就怀疑是不是这个体系  用来做土壤DNA 这样成分复杂的模板是不合适的 ~ 可是也不知道究竟从何下手, 退火温度   以前用60度 曾经做出来过 就是上面第二张图那样子的    我现在把上下5度的都试过了  依然~~
现在倒好 连个条带都么有 全部成弥散 了 ~~
36楼2011-09-19 13:43:50
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yejian

铁虫 (小有名气)

★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
dhd997(金币+2): good 2011-09-20 08:00:54
第一是模板质量,看模板是不是CDNA,如果是cDNA可能会出现这样的情况,其次是降低模板浓度,因为PCR只要一点模板就可以了,三是做个梯度PCR,摸下退火条件,祝实验成功
圆圆
37楼2011-09-19 19:18:31
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shuangzi8761

银虫 (著名写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
你为何不重提DNA呢?
38楼2011-12-27 21:07:01
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hyacinth326

金虫 (正式写手)

★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
小丹木木(金币+2): 鼓励新虫积极发帖交流哦 2012-01-09 09:37:49
1、模板稀释,模板太亮了
2、引物的问题,用这对引物以前是否p出来过基因?
3、向pcr体系中加入5%左右的DMSO,增加产物特异性试试。
39楼2012-01-08 22:04:06
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q307078056

银虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
1、缓冲液是否自己制备?可考虑使用Takara、英俊的商业缓冲液试试

2、模板浓度是否太高?

3、引物是否设计合理?
人生不是一种享受,而是一桩沉重异常的工作
40楼2013-05-14 22:30:49
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