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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR 总是呈现涂抹状 求解答！
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lingonghua

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
dhd997(金币+2): 鼓励交流 2011-09-20 08:00:25
引物有没有问题？
我这两天做PCR，开始能扩出来，后来优化完善体系的时候反而扩不出来了。然后把原先备份的引物粉末重新溶解稀释，就又能扩出来了。

另一个是dNTP，我的40微升体系，一开始用4微升扩不出来，减到2微升反而能扩出来。
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31楼2011-09-18 17:40:32
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老夏853

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
31楼: Originally posted by lingonghua at 2011-09-18 17:40:32:
引物有没有问题？
我这两天做PCR，开始能扩出来，后来优化完善体系的时候反而扩不出来了。然后把原先备份的引物粉末重新溶解稀释，就又能扩出来了。

另一个是dNTP，我的40微升体系，一开始用4微升扩不出来，减 ...

这个 引物我当初合成的时候2OD 分装两管 发现做不出来的时候 我另一管也用了 依然做不出来
你说那个DNTP,我们用的是混合好的mix  里面的dntp 各是0.4mM  ~~
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32楼2011-09-18 20:29:59
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jinkui960

至尊木虫 (知名作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
感觉象是DNA的模板浓度太高，稀释模板试试，祝好运！
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33楼2011-09-19 09:08:36
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老夏853

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
33楼: Originally posted by jinkui960 at 2011-09-19 09:08:36:
感觉象是DNA的模板浓度太高，稀释模板试试，祝好运！

恩 老师 您好
我现在已经稀释过 10,20,50.100倍，效果时一样的
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34楼2011-09-19 10:09:24
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jinkui960

至尊木虫 (知名作家)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
dhd997(金币+2): good 2011-09-20 08:00:43
引用回帖:
34楼: Originally posted by 老夏853 at 2011-09-19 10:09:24:
恩 老师 您好
我现在已经稀释过 10,20,50.100倍，效果时一样的

建议换用其他同学的PCR扩增体系，包括去离子水，dNTP，如果还不行的话可能就是模板的问题，重新提模板试试！
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35楼2011-09-19 12:57:16
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老夏853

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
35楼: Originally posted by jinkui960 at 2011-09-19 12:57:16:
建议换用其他同学的PCR扩增体系，包括去离子水，dNTP，如果还不行的话可能就是模板的问题，重新提模板试试！

恩 谢谢老师
我们用的是混合的extaq 酶  takara 的  
水是我问养细胞的同学要的超纯水，
再就是加的 BSA 作为保护剂
东西都换过  也重新提过模板
我现在 就怀疑是不是这个体系  用来做土壤DNA 这样成分复杂的模板是不合适的 ~ 可是也不知道究竟从何下手， 退火温度   以前用60度 曾经做出来过 就是上面第二张图那样子的    我现在把上下5度的都试过了  依然~~
现在倒好 连个条带都么有 全部成弥散 了 ~~
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36楼2011-09-19 13:43:50
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yejian

铁虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
dhd997(金币+2): good 2011-09-20 08:00:54
第一是模板质量，看模板是不是CDNA，如果是cDNA可能会出现这样的情况，其次是降低模板浓度，因为PCR只要一点模板就可以了，三是做个梯度PCR，摸下退火条件，祝实验成功
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圆圆
37楼2011-09-19 19:18:31
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shuangzi8761

银虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
你为何不重提DNA呢？
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38楼2011-12-27 21:07:01
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hyacinth326

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
小丹木木(金币+2): 鼓励新虫积极发帖交流哦 2012-01-09 09:37:49
1、模板稀释，模板太亮了
2、引物的问题，用这对引物以前是否p出来过基因？
3、向pcr体系中加入5%左右的DMSO，增加产物特异性试试。
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39楼2012-01-08 22:04:06
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q307078056

银虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
1、缓冲液是否自己制备？可考虑使用Takara、英俊的商业缓冲液试试

2、模板浓度是否太高？

3、引物是否设计合理？
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人生不是一种享受，而是一桩沉重异常的工作
40楼2013-05-14 22:30:49
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