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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 聚丙烯酰胺凝胶电泳
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linda1838

新虫 (初入文坛)

[求助] 聚丙烯酰胺凝胶电泳

现在在做聚丙烯酰胺电泳，胶浓度为15%，电压100v，电流30mA左右。运行后15min，loadingbuffer都不动，这是怎么回事？现在实验都不能进行了。
我确定我的loadingbuffer质量是没问题的。我觉得我可能是细节上出了问题，求高手指点！
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1楼 2011-09-05 09:19:55
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zlu520

至尊木虫 (职业作家)

限制人

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5): good 2011-09-12 08:35:41
引用回帖:
1楼: Originally posted by linda1838 at 2011-09-05 09:19:55:
现在在做聚丙烯酰胺电泳，胶浓度为15%，电压100v，电流30mA左右。运行后15min，loadingbuffer都不动，这是怎么回事？现在实验都不能进行了。
我确定我的loadingbuffer质量是没问题的。我觉得我可能是细节上出了问 ...

是不是胶浓度有问题。浓缩胶浓度一般为3%-5%，分离胶浓度根据待分离样品的情况选择适当的分离胶浓度，通常使用的15％的聚丙烯酰胺凝胶的分离范围是104～105，即分子量小于104的蛋白质可以不受孔径的阻碍而通过凝胶，而分子量大于105的蛋白质则难以通过凝胶孔径，这两种情况的蛋白质都不能得到分离。所以如果要分离较大的蛋白质，需要使用低浓度如10％或7.5%的凝胶（孔径较大）；而对于分离较小的蛋白质，使用的较高浓度凝胶（孔径较小）可以得到更好的分离效果。
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无完人！
2楼2011-09-05 09:51:25
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zlu520

至尊木虫 (职业作家)

限制人

【答案】应助回帖

引用回帖:
1楼: Originally posted by linda1838 at 2011-09-05 09:19:55:
现在在做聚丙烯酰胺电泳，胶浓度为15%，电压100v，电流30mA左右。运行后15min，loadingbuffer都不动，这是怎么回事？现在实验都不能进行了。
我确定我的loadingbuffer质量是没问题的。我觉得我可能是细节上出了问 ...

是不是胶浓度有问题。浓缩胶浓度一般为3%-5%，分离胶浓度根据待分离样品的情况选择适当的分离胶浓度，通常使用的15％的聚丙烯酰胺凝胶的分离范围是104～105，即分子量小于104的蛋白质可以不受孔径的阻碍而通过凝胶，而分子量大于105的蛋白质则难以通过凝胶孔径，这两种情况的蛋白质都不能得到分离。所以如果要分离较大的蛋白质，需要使用低浓度如10％或7.5%的凝胶（孔径较大）；而对于分离较小的蛋白质，使用的较高浓度凝胶（孔径较小）可以得到更好的分离效果。
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无完人！
3楼2011-09-05 09:52:02
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linda1838

新虫 (初入文坛)
不好意思我没有说完全，我用的是非变性，连续的凝胶系统。分离的物质是十几个碱基的寡核苷酸。我觉得即使是凝胶浓度大了点，跑15分钟，不能连buffer都不带动的啊。
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4楼2011-09-05 09:58:37
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hf2016

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

这事儿我干过，后来重新配了凝胶再跑就没问题了，当时也没找出什么原因，期待高手回答呵呵
重新做块胶试试吧
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一切开始于结束之后
5楼2011-09-05 12:51:10
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临风7071

木虫 (正式写手)
我也做非变性的电泳，我的溴酚蓝到底了，可是我的蛋白还在上样孔附近，悲剧啊
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6楼2011-09-05 14:12:16
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wanhscn

木虫 (职业作家)

哲学@草根

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): good 2011-09-12 08:36:05
linda1838(金币+1): 就这样吧 2011-11-28 15:16:30
引用回帖:
4楼: Originally posted by linda1838 at 2011-09-05 09:58:37:
不好意思我没有说完全，我用的是非变性，连续的凝胶系统。分离的物质是十几个碱基的寡核苷酸。我觉得即使是凝胶浓度大了点，跑15分钟，不能连buffer都不带动的啊。

十几个碱基的PAGE，一般用19：1（ARC：BIS-ARC）的8-10%胶，15%的胶太大，是不是你自己想的？同时缓冲液也要注意，缓冲液没有达到浓度，离子浓度不够，也跑不下来。建议按照 分子克隆手册 重来
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真相是最大的奢侈品
7楼2011-09-05 14:39:06
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ltgodzilla

新虫 (初入文坛)
我也有过类似的情况……
楼主确定是一动不动吗？还是动的极慢？
按照楼主说法，15min如果有移动一点点，那楼主看看电流是多少，我用的也是连续凝胶系统，120v，正常一块胶电流在23~25mA，2块胶在43mA左右……如果低于这个值，除了楼上各位建议的配胶问题外，可能还有电泳槽安装问题，外液是否过高，胶板是否未夹紧导致短路等等……
PS：我用的是伯乐的预制胶，有时候底下的密封胶带忘了撕也会跑不动……如果楼主自己配的就没这个问题了……
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8楼2013-07-19 16:02:50
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