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passingby

铜虫 (小有名气)

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专业: 遗传学与生物信息学

[交流] SSR-PCR求助已有16人参与

本人开始做SSR标记不久，但总是做不出让人满意的结果来，不是PCR出了问题，就是跑胶出问题，版里谁做过SSR标记的给我支个招，看看我做的聚丙烯酰胺凝胶电泳问题出在哪里，给点参考建议，我下面该如何优化是好

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不能再走一步算一步了，我要计划好每一步该怎么走，起码要做到心中有数！

1楼2011-08-14 22:38:12

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kidluag

金虫 (正式写手)

不自信的师生

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虫号: 1633228
注册: 2012-02-22
性别: MM
专业: 蔬菜学与瓜果学

★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
小丹木木(金币+2): 鼓励积极交流哦 2012-02-22 08:20:04

PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次，是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶的量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策）有：①必要时，重新设计引物。②减低酶的量或调换另一来源的酶。③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸，也叫两步法)。
PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶的量过大或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：①减少酶的量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。③适当降低Mg2+浓度。④增加模板量，减少循环次数