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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 荧光定量怎么成了这样
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

疯狂修行者(金币+2): 谢谢，我降低反应温度试试吧，引物我设了好多了，能出单峰的就很少，现在扩增效率又低，真郁闷！ 2011-08-12 14:14:30
本来木有时间回帖的，想想还是回答下，哥们你实验顺利了才有时间弄Journal Club，哈哈~
扩增效率低可以从这三个方面考虑：
1.试剂部分成分，特别是荧光染料降解了。可以换新的试剂做一次看看。
2.优化反应程序：（1）降低退火温度；（2）如果你是两步法（退火和延伸一个温度），改成三步法（即：变性，退火，延伸这种传统的程序。
3.可能是模板中有PCR反应抑制剂。可以减少模板量（稀释之后再加）。荧光定量PCR很灵敏，你稀释个10倍应该没关系。
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11楼2011-08-11 12:10:21
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shuanyu0202

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

疯狂修行者(金币+2): 谢谢，我降低反应温度试试吧，引物我设了好多了，能出单峰的就很少，现在扩增效率又低，真郁闷！ 2011-08-12 14:16:55
引用回帖:
10楼: Originally posted by 疯狂修行者 at 2011-08-11 08:27:28:
现在扩增效率低怎么办？

怎么确定的扩增效率低呢？如果是因为CT值延迟的话，有几个原因：1.扩增效率低，反应条件不够优化。（设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应； 适当降低退火温度；增加镁离子浓度等）。
2.PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。
3.PCR产物太长。一般采用80-150bp的产物长度。
希望对你有所帮助，实验顺利。
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12楼2011-08-11 12:39:41
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apple6299

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

疯狂修行者(金币+1): 谢谢 2011-08-12 14:17:10
首先  这是溶解曲线  单峰说明设计的引物特异性很好，Tm在85-90  是属于可信范围
其次  你这是重复试验吗？如果是的话，折叠曲线就很不好了，建议操作的过程中，先混合，再分装
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13楼2011-08-11 16:41:08
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zcqcau

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

疯狂修行者(金币+1): 谢谢 2011-08-12 14:17:23
退火温度 反应体系 和重新合成引物 都是可以改变扩增效率低的问题的
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将有能量帮助他人作为自己的人生追求！
14楼2011-08-11 17:48:52
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lzpbar

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

疯狂修行者(金币+1): 关键是我用的是mix，只能变变退火温度了！ 2011-08-12 14:18:13
首先这个是染料法的熔解曲线图，通过熔点来判断特异性，即是否存在引物二聚体或非特异扩增等。如果是基因表达相对定量，要确定目标基因和参考基因的扩增效率一致性，可从以下方面确定和优化扩增效率：1）确定扩增效率。可通过阳性标准品比如质粒的梯度稀释和标准曲线来确定，或者通过免费软件DART-PCR、LinRegPCR等来计算。2）扩增效率优化。多设计几对引物进行筛选是最重要的，效果远好于后续的优化。如果说引物筛选是粗调，那么优化只是细调，优化的主要对象包括[Mg2+]浓度、退火温度、PCR buffer类型、酶用量等。
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举而措之天下之民，谓之事业
15楼2011-08-11 18:19:31
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未知树

木虫 (著名写手)
帮你顶顶，楼主很幸福， 楼上好多答案都很不错， 楼主就先试试
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每一天都是一个新的起点
16楼2011-08-12 00:40:05
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大钉子

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

单峰的很好啊~是同一个做的重复？
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疯狂修行者
17楼2011-08-12 13:30:58
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匿名

用户注销 (初入文坛)
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疯狂修行者
18楼2011-12-26 15:35:13
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疯狂修行者

木虫 (正式写手)
送鲜花一朵
引用回帖:
17楼: Originally posted by 大钉子 at 2011-08-12 13:30:58:
单峰的很好啊~是同一个做的重复？

恩，是的
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戒骄戒躁，坦荡做人，平常心做事，享受生活之美！！
19楼2011-12-29 18:35:23
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疯狂修行者

木虫 (正式写手)
送鲜花一朵
引用回帖:
18楼: Originally posted by 472072112 at 2011-12-26 15:35:13:
增加模板量，

谢谢
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戒骄戒躁，坦荡做人，平常心做事，享受生活之美！！
20楼2011-12-29 18:35:44
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