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rainontime

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[求助] 求助双酶切验证阳性克隆的问题

本人将某 2600bp的目的基因和 pet28a载体双酶切，切胶回收，T4连接酶4度过夜连接，将10uL连接产物加到120uL感受态细胞中，加入800uL无抗性培养基摇菌50分钟，涂平板10块，每块80uL, 过夜后，发现只长了一个菌落。。。挑取菌落培养，提取质粒，双酶切验证是否是阳性克隆，切成了两条片段，发现其中较短的那条片段比目的片段长！！！！！！！请问这是咋回事？谢谢！！！

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1楼 2011-08-01 16:05:57

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charles08

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我连接前的片段还经过酶切、测序验证的
胶回收后还进行了电泳
只是感觉浓度稀点，比MARKER薄点
但是今天做完转化8个板子中间有好些个没一个斑的

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11楼2013-11-01 09:49:31

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duckcat

银虫 (初入文坛)

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【答案】应助回帖

rainontime(金币+1): 不错的 2011-08-01 18:10:16
1949stone(MolEPI+1): 不错不错 2011-08-01 20:31:33

这是很正常的，一般酶切后的目的片段往往比pcr扩增得到的跑胶拖后，主要有以下几个物理因素造成：
1，因为载体属于比较大的分子了，质粒如果浓度较高的话，难免分子间的作用力较强，因为这种力的存在导致了目的片段跑胶速度较慢！
2, 可能切得时间比较长，导致许多分子杂质增多！
3，如果很靠后的话极有可能你的凝胶浓度不均匀……

暂时想到这么多！

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2楼2011-08-01 17:23:48

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rainontime

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引用回帖:

2楼: Originally posted by duckcat at 2011-08-01 17:23:48:
这是很正常的，一般酶切后的目的片段往往比pcr扩增得到的跑胶拖后，主要有以下几个物理因素造成：
1，因为载体属于比较大的分子了，质粒如果浓度较高的话，难免分子间的作用力较强，因为这种力的存在导致了目的片 ...

我用的是自己配的0.7%的胶，而且为了把条带拉开，跑了20分钟，因为片段比较大。。。。。。是不是这样也会导致位置偏移？谢谢！

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3楼2011-08-01 18:08:50

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