应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 重叠延伸 ，为什么用连接后的片段作为模板却扩不出来？
52/1返回列表
查看: 1559  |  回复: 12
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

追寻风轻扬

金虫 (小有名气)

[求助] 重叠延伸 ，为什么用连接后的片段作为模板却扩不出来？

烦请各位帮帮忙   两个外显子  200bp 和1000bp的  重叠延伸pcr扩出1200的  胶回收后  用1200的作为模板  却扩不出来了     而且还有一条250左右的片段  为什么啊 ？问题可能出在哪儿呢？
回复此楼

» 猜你喜欢
幸福只道是寻常
1楼 2011-07-22 22:37:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

追寻风轻扬

金虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by shaquila at 2011-08-16 17:38:55:
东洋纺的kod plus～～
应该不难出来吧，只要是高保真酶，应该都差不多呀，就是模版量一定要大，我是回收产物直接各上样3ul～～

谢谢你！我没有用高保真酶，只是用的一般的taq酶，这会影响很大吗？前阶段把产物送去测序了，结果是两端各少了二三十bp没测出来，您说这是啥原因啊！
赞一下 回复此楼
幸福只道是寻常
11楼2011-08-21 17:31:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 13 个回答

西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
dhd997(金币+3): good 2011-07-24 09:13:01
PCR扩不出来，可以降低退火温度试试。
不过如果用原来扩增200bp和1000bp的引物来扩1200bp的引物，一般比较难，原理我不记得了。
我们一般这样子做：当初扩你那两个片段的时候（姑且称为A片段和B片段，A在左B在右），A的左端和B的右端额外多扩几个到几十个碱基；另外再设计一对嵌套引物，位点就在你需要的A的左端和B的右端，用它来扩增融合产物，得到你真正需要的产物。一句话，就是融合时使得融合产物比想要的产物长一点，之后再用一对新的引物把目的产物P出来。
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2011-07-23 17:10:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

追寻风轻扬

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 西瓜 at 2011-07-23 17:10:54:
PCR扩不出来，可以降低退火温度试试。
不过如果用原来扩增200bp和1000bp的引物来扩1200bp的引物，一般比较难，原理我不记得了。
我们一般这样子做：当初扩你那两个片段的时候（姑且称为A片段和B片段，A在左B在右 ...

谢谢！但是我已经连接得到1200大小的片段了，只是用1200的再作为模板就扩不出来了。难道那1200左右的片段不是我要的，而是错配扩出来的？还是两端引物的问题？在A和B的外侧再多出一些片段可以起到什么作用啊？谢谢啦.
赞一下 回复此楼
幸福只道是寻常
3楼2011-07-26 22:12:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cloverplm

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜(金币+2): 鼓励 2011-07-30 23:33:59
引用回帖:
Originally posted by 追寻风轻扬 at 2011-07-26 22:12:13:
谢谢！但是我已经连接得到1200大小的片段了，只是用1200的再作为模板就扩不出来了。难道那1200左右的片段不是我要的，而是错配扩出来的？还是两端引物的问题？在A和B的外侧再多出一些片段可以起到什么作用啊？ ...

PCR扩增有1%的突变率，也有可能是你扩增的片段突变了。
引物的问题也不能排除。
在两端再加一些片段能保证扩增方向以及减少扩增过程中的错配。
赞一下(1人) 回复此楼
净——静——竞——进
4楼2011-07-26 22:44:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 13 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 341求调剂 +5 捣蛋猪猪 2026-03-11 6/300 2026-03-17 17:16 by ruiyingmiao
[考研] 312求调剂 +4 陌宸希 2026-03-16 5/250 2026-03-17 17:09 by ruiyingmiao
[考研] [导师推荐]西南科技大学国防/材料导师推荐 +3 尖角小荷 2026-03-16 6/300 2026-03-16 23:21 by 尖角小荷
[考研] 286求调剂 +3 lemonzzn 2026-03-16 5/250 2026-03-16 20:43 by lemonzzn
[考研] 机械专硕325，寻找调剂院校 +3 y9999 2026-03-15 5/250 2026-03-16 19:58 by y9999
[考研] 环境工程调剂 +6 大可digkids 2026-03-16 6/300 2026-03-16 17:16 by barlinike
[考研] 304求调剂 +4 ahbd 2026-03-14 4/200 2026-03-16 16:48 by 我的船我的海
[考研] 318求调剂 +3 Yanyali 2026-03-15 3/150 2026-03-16 16:41 by houyaoxu
[考研] 中科院材料273求调剂 +4 yzydy 2026-03-15 4/200 2026-03-16 15:59 by Gaodh_82
[考研] 070303 总分349求调剂 +3 LJY9966 2026-03-15 5/250 2026-03-16 14:24 by xwxstudy
[考研] 0703 物理化学调剂 +3 我可以上岸的对� 2026-03-13 5/250 2026-03-16 10:50 by 我可以上岸的对�
[考研] 341求调剂 +3 番茄头--- 2026-03-10 3/150 2026-03-13 23:07 by JourneyLucky
[考研] 279求调剂 +3 Dizzy123@ 2026-03-10 3/150 2026-03-13 23:02 by JourneyLucky
[考研] 0703化学调剂 +4 快乐的香蕉 2026-03-11 4/200 2026-03-13 22:41 by JourneyLucky
[考研] 308求调剂 +5 是Lupa啊 2026-03-11 5/250 2026-03-13 22:13 by JourneyLucky
[考研] 四川大学085601材料工程专硕 初试294求调剂 +4 祝我们好在冬天 2026-03-11 4/200 2026-03-13 21:39 by peike
[考研] 310求调剂 +3 【上上签】 2026-03-11 3/150 2026-03-13 16:16 by JourneyLucky
[考研] 085600材料与化工 309分请求调剂 +7 dtdxzxx 2026-03-12 8/400 2026-03-13 14:43 by jxchenghu
[考博] 福州大学杨黄浩课题组招收2026年专业学位博士研究生，2026.03.20截止 +3 Xiangyu_ou 2026-03-12 3/150 2026-03-13 09:36 by duanwu655
[考研] 333求调剂 +3 152697 2026-03-12 4/200 2026-03-13 07:08 by Iveryant
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭