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wsz2056

金虫 (小有名气)

[交流] s蛋白纯化

镍柱纯化蛋白，杂蛋白会不会比目的蛋白与镍柱的结合更牢固？谢谢
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1楼 2011-07-21 15:31:32
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)
引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2011-07-22 17:19:29:
你说芳龄47，人家就不会误会了
如果杂蛋白和带his-taq的蛋白都结合得很严密，可以先全部高浓度咪唑洗下来后，切掉标签反穿。（以前不知道听谁说的，貌似主意很不错）

这个办法也是可以的，现在切掉标签的酶可能也没那么贵了。但是有一个问题，要是标签是暴露在外的，那么就会与镍柱结合紧密，在150或者100nM的时候才会被大量洗脱下来，现在结合不紧密，表明标签被折叠进内部了，不知道还能不能切去。
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13楼2011-07-22 18:39:30
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zsy1106

金虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★
wsz2056(金币+1):谢谢参与
amisking(金币+4): 鼓励发帖交流。 2011-07-21 20:29:38
先简单介绍下NI柱纯化蛋白的原理吧。NI柱纯化依据的是组氨酸能与多种过渡金属离子Ni2+，Co2+等发生特殊的相互作用，因此可以把富含这类氨基酸的蛋白质吸附，从而达到分离的目的。镍离子有六个螯合价数，除掉和柱子配基螯合掉的价数，剩余的就是可以和蛋白中组氨酸螯合掉的价数。
通常我们在目的蛋白上会融合6个组氨酸，只要这六个组氨酸的位点在蛋白质表面而不是被包在构象内部，就可以在合适的条件下挂在柱子上，再通过一定浓度的咪唑洗脱。杂蛋白中一般不会有如此集中的组氨酸数目，所以即使有一两个组氨酸使得杂蛋白挂在柱子上，也容易在低浓度咪唑的时候就先被洗脱下来。当然，也没有人能保证不会有一些特殊的杂蛋白，其组氨酸数目更多更集中，就会比目的蛋白结合的还要牢固。但是通过梯度洗脱，应该也能一定程度上和目的蛋白分离。
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2楼2011-07-21 19:07:00
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zsy1106

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
dhd997(金币+2): 顾立之 2011-07-22 08:16:27
哦，还有一种情况，就是你的目的蛋白在折叠的时候把组氨酸标签包到内部而不在蛋白表面，而又恰巧杂蛋白表面有分布一定数量的组氨酸，也会导致杂蛋白比目的蛋白结合的牢固。
⊙﹏⊙b汗，总是再发表帖子之后想起有遗漏，我老了么？
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3楼2011-07-21 19:11:33
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
dhd997(金币+1): 透露个人信息啊，那不是快毕业了 2011-07-22 08:16:52
赞同楼上看法


你能比我老？本人芳龄二八
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4楼2011-07-21 19:33:54
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