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限制酶SexAI的保护碱基和定向克隆问题
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大家好： 请问限制酶SexAI的保护碱基怎么加？我打算加4个“Gs”，这样可以么？SexAI的识别序列是ACCWGGT(W=A/T)。我准备用SexAI做定向克隆，所用载体上游SexAI序列是5‘-ACCAGGT-3’;，下游SexAI序列是5‘-ACCTGGT-3’;(同一条链上的序列，即都在sense strand上，即：5‘-ACCAGGT-------------ACCTGGT-3‘) ，那么我的上下游引物的酶切位点怎么加啊？是加不同序列的SexAI， 5’-ACCAGGT-3‘+上游引物，5’-ACCTGGT-3‘+下游引物？这样好像无法连接到载体上，只能连接一头。还是加相同序列的SexAI，即：5’-ACCAGGT-3‘+上游引物， 5’-ACCAGGT-3‘+下游引物？这样的话插入片段就有可能以任意一个方向插入，即有两种方向的插入片段。 用不同序列的SexAI可以直接进行连接么？因为质粒双酶切（质粒上有两个不同序列的SexAI位点），酶切后形成的质粒两头的黏性末端是相同的（对么？原来这两个SexAI位点之间的序列就丢失了？），所以插入基因可以以任意一种方向连接，都会出现方向不正确和方向正确的序列。我有点陷进去了，大家帮我看是不是会产生两种方向的插入序列啊。 说明：两个SexAI位点分别位于质粒的两个MCS上，用的启动子是PnisA，具体序列如下图所示：   [ Last edited by mf2003 on 2011-7-15 at 10:11 ] |
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