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[求助]
求助胞内酶分离技术，离子交换
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| 采用梯度洗脱的方法，离子浓度梯度ph6.0。然后DEAE-52离子交换填料分离纯化酶，柱高30cm，内径1cm，上样量1.2ml。但是跑了3个小时也没有峰。确保目标酶存在于上样溶液中。而且ph6.0不影响酶活。。。。。。我做这个酶做了好几次了，采用葡聚糖凝胶G-100,200都试过也是没有分离，要么一个峰，要么没有峰。。。不知道咋回事，求助各位大侠了，在此谢过。 |
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【答案】应助回帖
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scelab(金币+5, EPI+1): 谢谢交流 2011-07-02 09:49:18
zhouhou(金币+2): 好 2011-07-02 10:13:49
scelab(金币+5, EPI+1): 谢谢交流 2011-07-02 09:49:18
zhouhou(金币+2): 好 2011-07-02 10:13:49
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首先看看你的蛋白质能不能被吸附，DEAE-52离子交换是弱阴离子交换，你选用pH6.0，那么你的目标蛋白质等电点一定要低于6.0才能被吸附，确切地说，要有0.5个pH值差别才能保证被吸附。 跑了3个小时都没有蛋白质峰，会不会是上样的蛋白质太少，少到仪器检测不出差别的程度？因为3个小时过去了，才这么点柱床体积，都不知道洗了多少倍了，要出来早就出来了。还有可能是离子强度不够强，不能洗脱这些蛋白质，我用强阴HiPrep Q XL和其它弱阴、强阳、弱阳的时候最后都用2M氯化钠去清洗的，有时也能洗下来一点点蛋白质，你用来洗脱的离子强度可能不够高。理论上，你的目标蛋白质等电点离选用的pH值越远，解离的可用于交换吸附的基团越多，与层析柱结合的程度越紧密，需要的洗脱的离子强度越大。顺便说一声，0.5M的氢氧化钠pH值可能达到13，对你的弱阴离子交换填料不好，如果你要用，那么洗脱时间别太长。我还是建议你先用pH6.0的高浓度的氯化钠来洗脱，实在不行才换用氢氧化钠。 |
3楼2011-07-02 01:36:43