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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 求助胞内酶分离技术，离子交换
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zhouhou

捐助贵宾 (小有名气)

[求助] 求助胞内酶分离技术，离子交换

采用梯度洗脱的方法，离子浓度梯度ph6.0。然后DEAE-52离子交换填料分离纯化酶，柱高30cm，内径1cm，上样量1.2ml。但是跑了3个小时也没有峰。确保目标酶存在于上样溶液中。而且ph6.0不影响酶活。。。。。。我做这个酶做了好几次了，采用葡聚糖凝胶G-100,200都试过也是没有分离，要么一个峰，要么没有峰。。。不知道咋回事，求助各位大侠了，在此谢过。
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1楼 2011-07-01 21:50:54
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献

【答案】应助回帖

★ ★
scelab(金币+2): 谢谢交流 2011-07-02 09:49:07
蛋白跟填料有结合，可能挂柱了。用0.5或者1M的NaOH洗洗看出来的是不是你的蛋白。
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
2楼2011-07-01 22:17:01
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
scelab(金币+5, EPI+1): 谢谢交流 2011-07-02 09:49:18
zhouhou(金币+2): 好 2011-07-02 10:13:49
首先看看你的蛋白质能不能被吸附，DEAE-52离子交换是弱阴离子交换，你选用pH6.0，那么你的目标蛋白质等电点一定要低于6.0才能被吸附，确切地说，要有0.5个pH值差别才能保证被吸附。   

跑了3个小时都没有蛋白质峰，会不会是上样的蛋白质太少，少到仪器检测不出差别的程度？因为3个小时过去了，才这么点柱床体积，都不知道洗了多少倍了，要出来早就出来了。还有可能是离子强度不够强，不能洗脱这些蛋白质，我用强阴HiPrep Q XL和其它弱阴、强阳、弱阳的时候最后都用2M氯化钠去清洗的，有时也能洗下来一点点蛋白质，你用来洗脱的离子强度可能不够高。理论上，你的目标蛋白质等电点离选用的pH值越远，解离的可用于交换吸附的基团越多，与层析柱结合的程度越紧密，需要的洗脱的离子强度越大。顺便说一声，0.5M的氢氧化钠pH值可能达到13，对你的弱阴离子交换填料不好，如果你要用，那么洗脱时间别太长。我还是建议你先用pH6.0的高浓度的氯化钠来洗脱，实在不行才换用氢氧化钠。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
3楼2011-07-02 01:36:43
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