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yesucao

木虫 (正式写手)

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专业: 微生物生理与生物化学

[求助] 载体连接

我的实验情况如下：
1、目的基因片段和表达载体同时进行双酶切，割胶回收，跑胶验证，晚上进行连接；（回收的大小没有问题）
2、转化大肠杆菌DH5a；
3、转化子PCR验证目的片段的大小；（条带大小正确）
4、挑取转化子摇菌、提质粒并进行双酶切验证，（这个时候出现问题了）

问题如下：
1、重组质粒双酶切显示：目的基因的片段大小正确 720bp，但是载体大片段的大小只有3500bp，按理说的话载体的大片段有5500bp左右的；
2、重组质粒单酶切显示：条带大小显示在3500-5500之间；（似乎和双酶切两条片段的大小之和一致）
按照重组质粒的单、双酶切实验验证，在提质粒、酶切上实验没有问题，转化实验本身也没有问题，难道是我连接有问题？？？

我的连接体系：
目的片段 12微升
载体    4微升
T4          2微升
Buffer    2微升

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1楼 2011-07-01 16:45:51

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足下客

木虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): good 2011-07-03 18:09:37
yesucao(金币+2): 2011-07-04 12:21:47

可能的原因是你选择的内切酶在载体上有可以识别的切割位点，即内切酶把你的载体给切断了，所以在连接后载体片段会变小。
建议：核对内切酶表，确认载体上没有可被识别的切割位点。但是内切酶表有时候也不可靠，所以要想最终搞清楚原因只能以载体序列为目标，设计引物，测序，看一下载体序列是否有缺失。
如果觉得这样做太麻烦，只能换内切酶。