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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 载体连接
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yesucao

木虫 (正式写手)

[求助] 载体连接

我的实验情况如下：
1、目的基因片段和表达载体同时进行双酶切，割胶回收，跑胶验证，晚上进行连接；（回收的大小没有问题）
2、转化大肠杆菌DH5a；
3、转化子PCR验证目的片段的大小；（条带大小正确）
4、挑取转化子摇菌、提质粒并进行双酶切验证，（这个时候出现问题了）

问题如下：
1、重组质粒双酶切显示：目的基因的片段大小正确 720bp，但是载体大片段的大小只有3500bp，按理说的话载体的大片段有5500bp左右的；
2、重组质粒单酶切显示：条带大小显示在3500-5500之间；（似乎和双酶切两条片段的大小之和一致）
按照重组质粒的单、双酶切实验验证，在提质粒、酶切上实验没有问题，转化实验本身也没有问题，难道是我连接有问题？？？

我的连接体系：
目的片段 12微升
载体     4微升
T4           2微升
Buffer      2微升
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1楼 2011-07-01 16:45:51
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wutongyu77

铜虫 (初入文坛)
你选择的内切酶是不是有问题啊，不具有特异性啊
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选择好自己要走的路，走好自己所选择的路
2楼2011-07-01 17:24:19
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yuxia82012

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
yesucao(金币+3): 还是等我再做一次确认一下，不过你的建议也是可行的 2011-07-01 20:08:42
1949stone(金币+1): 可行 2011-07-01 21:31:46
确定你的载体是不是正确了？如果目的基因大小正确的话，你可以拿去测下序，个人认为很可能是载体弄错了
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在等待中涅槃重生
3楼2011-07-01 17:49:31
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★ ★
yesucao(金币+3): 我也是打算重新做的，只是想知道自己到底会在那个环节出现问题 2011-07-01 18:50:21
dhd997(金币+3): 2011-07-01 19:29:07
不是你连接的问题；
其实第一个问题和第二个应该是一个问题，你确定你的载体没有什么问题，在你连接前，酶切纯化载体后的大小是多少？5500bp吗？
然后你连接之后酶切验证时，酶切下来载体就变成3500bp了？确实挺奇怪的，我从来没有遇到过着怎样的问题！

重复了吗？
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
4楼2011-07-01 17:54:22
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苏拉的世界

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
dhd997(金币+1): good 2011-07-03 18:09:24
yesucao(金币+2): 2011-07-04 12:20:34
亲爱的，电泳的时候会有别的情况出现的，可能是你的载体的问题吧，乱了
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关关雎鸠，在河之洲
5楼2011-07-03 10:24:11
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足下客

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): good 2011-07-03 18:09:37
yesucao(金币+2): 2011-07-04 12:21:47
可能的原因是你选择的内切酶在载体上有可以识别的切割位点，即内切酶把你的载体给切断了，所以在连接后载体片段会变小。
建议：核对内切酶表，确认载体上没有可被识别的切割位点。但是内切酶表有时候也不可靠，所以要想最终搞清楚原因只能以载体序列为目标，设计引物，测序，看一下载体序列是否有缺失。
如果觉得这样做太麻烦，只能换内切酶。
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6楼2011-07-03 11:03:31
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lahsxl

铁虫 (初入文坛)
不知道你的问题解决了没有，我也出现过类似的情况 ，可能是在过程中有污染，我就是把类似电泳缓冲液啊等能换的都换成新的就好了，不知道对你有没有帮助呵呵
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7楼2011-07-24 22:49:01
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yesucao

木虫 (正式写手)
已经解决了，是载体出现问题了，拿来的时候没有经过验证，有个酶有两个酶切位点，已经换载体了，谢谢你的关心。
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8楼2011-07-25 19:28:56
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