应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 药学 » 药理学 » 流式上机前细胞预处理的困惑
101/1返回列表
查看: 2606  |  回复: 9
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

xiajing_acm

新虫 (小有名气)

[求助] 流式上机前细胞预处理的困惑

各位大侠：

你们好！

小弟最近做流式，上机的时候发现流式细胞仪几乎读不了细胞（A549肺腺癌细胞），细胞流量几个每秒，让我郁闷的不行！当时不知道是什么原因，时候查看流式管里的细胞才发现：里面的细胞大部分还是呈絮状的白色沉淀存在，我才知道是细胞没有混悬好，没有以单个细胞的形式存在。可我有几点疑问：

1、PI单染的细胞我是用70%的乙醇固定过夜的，第二天发现细胞就沉在流式管的底部（絮状）。70%的乙醇用的时候是现配现用的，没有预冷，沉淀不知道跟这有没有关系呢？有的资料说在固定时应该先加PBS混悬细胞后再加乙醇到70%浓度比较好，说直接加70%乙醇细胞难被吹散，不知道是不是这样呢？

2、在用PBS洗过，加PI后，我用枪头混悬了可是看到细胞已经被吹散了啊？然后避光孵育了差不多1个小时。上机的时候没有仔细检查流式管内的细胞，就直接上机了！

3、Annexin V-PI双染（说明书上没要求固定，我就没有固定）我是用PBS混悬，然后离心，按试剂盒上说明加入反映试剂，然后也混悬了比较久的！

4、还有一点，会不会是A549细胞本身的一些特点，比如易粘连、易结团等导致其出现细胞沉淀的呢？

不知做过流式的各位大侠们有没有遇到过相关的问题呢？急切盼望指点一二！非常感谢！
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

细胞

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2011-06-28 17:45:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

inthesun

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
westzilch(金币+1): 谢谢交流！ 2011-06-29 00:07:18
xiajing_acm(金币+5): 非常感谢指点！ 2011-06-29 20:56:37
qinhy(金币+1): 多谢应助回帖~~~ 2011-07-10 19:45:27
你可以取一点你的分散液，在上机前在倒置显微镜下看看细胞状态
固定的时候是有沉淀的，这个现象是正常的，
PI加药后15min就可以上机检测，最好在1小时内检测完毕，孵育实验太久，因PI的毒性使细胞坏死

Annexin V-PI双染，不用固定，孵育15min直接检测
A549细胞没有做过，不清楚，做周期和凋亡和细胞还是有很大关系的，祝好运
赞一下(2人) 回复此楼
2楼2011-06-28 19:56:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sntyc

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

xiajing_acm(金币+1): 谢谢！ 2011-06-29 21:05:06
xiajing_acm(金币+1): 谢谢！ 2011-07-05 16:45:30
重点是吹散，固定久了肯定是有沉淀的
赞一下 回复此楼
3楼2011-06-28 23:55:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xiajing_acm

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by inthesun at 2011-06-28 19:56:29:
你可以取一点你的分散液，在上机前在倒置显微镜下看看细胞状态
固定的时候是有沉淀的，这个现象是正常的，
PI加药后15min就可以上机检测，最好在1小时内检测完毕，孵育实验太久，因PI的毒性使细胞坏死

Annex ...

谢谢啦！我今天发现流式管的管底有淡红色的絮状物，这是不是细胞坏死后里面的DNA漏出而被染色呢？有人说DNA漏出后粘附在细胞上难以吹散，不知道是不是这样的呢？
赞一下 回复此楼
4楼2011-06-29 20:59:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xyxj321

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

xiajing_acm(金币+2): 谢谢交流 2011-07-05 16:45:15
A549好像是不怎么好养，稍微密一点就会一片一片的死！
赞一下 回复此楼
啊啊啊啊
5楼2011-06-30 22:32:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

崔敏

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
karl2100(金币+1): 谢谢应助！ 2011-07-10 09:20:48
xiajing_acm(金币+3): 2011-07-11 17:00:40
1，加药A549细胞消化然后离心，用70%的乙醇固定过夜的，我做的一直都是先加150ul 的PBS，然后再加350ul 的纯乙醇固定，而且滴加纯乙醇的时候要求缓慢滴加，一边滴加一边混匀，这样效果比较好，也从没出现过楼主的问题。

2.细胞在用枪吹散的过程中还应该注意不能太用力，否则细胞破损影响效果。上流式之前，把在流式管中的细胞轻轻的弹起，不能直接把沉底的细胞上流式，这样做还容易把流式堵了。
赞一下(1人) 回复此楼
6楼2011-07-10 08:51:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

changecheng

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

xiajing_acm(金币+2): 2011-07-12 21:53:50
一般都是先用PBS混悬，离心后再用冰浴过的70%乙醇固定，而且用PBS还有洗涤的作用。我做的都是固定24小时。不过的确很难吹散呀，还不能大力吹碎细胞的说。
赞一下 回复此楼
7楼2011-07-12 20:15:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

mumiandtt

银虫 (小有名气)
引用回帖:
1楼: Originally posted by xiajing_acm at 2011-06-28 17:45:46:
各位大侠：

你们好！

小弟最近做流式，上机的时候发现流式细胞仪几乎读不了细胞（A549肺腺癌细胞），细胞流量几个每秒，让我郁闷的不行！当时不知道是什么原因，时候查看流式管里的细胞才发现：里面的细胞大 ...

你好，我看你的描述，为什么你用单染还用复染呢？我现在就是决定不了用单染还是复染，给点建议，谢谢
赞一下 回复此楼
学无止境努力再努力
8楼2011-09-24 18:48:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wangxiao2010

铜虫 (初入文坛)
★
karl2100(金币+1): 多谢指教！ 2011-12-19 23:58:57
流式细胞仪测定细胞周期，细胞固定方法：第一，先用PBS(PH-7.2)讲细胞吹散成但细胞悬液，再加入预冷的无水乙醇（加的时候要分次加入比如加700ul的无水乙醇，我一般分10次加入，每加入一次都要充分混匀），只要保证乙醇的终浓度为70%左右即可；第二，先用PBS将无水乙醇配制成70%的乙醇，然后然管壁将70%的乙醇（预冷的）缓慢加入管中，不要触及细胞沉淀，边加边旋转离心管，加入完毕后，用微量取样器轻轻吹打，一定要轻轻吹打。两种方法皆可。
  上机前，用预冷的PBS洗细胞两遍，最后一遍将PBS倒出后，把离心管倒扣在吸水纸上，保证细胞沉淀里无水分，然后染色。
  PI染色半小时即可，时间太长细胞碎片会增多。
赞一下(3人) 回复此楼
生活像等待创作的黏土，追求卓越！
9楼2011-12-19 22:16:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Letio

铁虫 (小有名气)
非常感谢！顶！
回复此楼
10楼2013-10-06 21:41:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 xiajing_acm 的主题更新
101/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭