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xiajing_acm新虫 (小有名气)
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[求助]
流式上机前细胞预处理的困惑
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各位大侠： 你们好！ 小弟最近做流式，上机的时候发现流式细胞仪几乎读不了细胞（A549肺腺癌细胞），细胞流量几个每秒，让我郁闷的不行！当时不知道是什么原因，时候查看流式管里的细胞才发现：里面的细胞大部分还是呈絮状的白色沉淀存在，我才知道是细胞没有混悬好，没有以单个细胞的形式存在。可我有几点疑问： 1、PI单染的细胞我是用70%的乙醇固定过夜的，第二天发现细胞就沉在流式管的底部（絮状）。70%的乙醇用的时候是现配现用的，没有预冷，沉淀不知道跟这有没有关系呢？有的资料说在固定时应该先加PBS混悬细胞后再加乙醇到70%浓度比较好，说直接加70%乙醇细胞难被吹散，不知道是不是这样呢？ 2、在用PBS洗过，加PI后，我用枪头混悬了可是看到细胞已经被吹散了啊？然后避光孵育了差不多1个小时。上机的时候没有仔细检查流式管内的细胞，就直接上机了！ 3、Annexin V-PI双染（说明书上没要求固定，我就没有固定）我是用PBS混悬，然后离心，按试剂盒上说明加入反映试剂，然后也混悬了比较久的！ 4、还有一点，会不会是A549细胞本身的一些特点，比如易粘连、易结团等导致其出现细胞沉淀的呢？ 不知做过流式的各位大侠们有没有遇到过相关的问题呢？急切盼望指点一二！非常感谢！ |
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 细胞 |
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【答案】应助回帖
★ ★
westzilch(金币+1): 谢谢交流！ 2011-06-29 00:07:18
xiajing_acm(金币+5): 非常感谢指点！ 2011-06-29 20:56:37
qinhy(金币+1): 多谢应助回帖~~~ 2011-07-10 19:45:27
westzilch(金币+1): 谢谢交流！ 2011-06-29 00:07:18
xiajing_acm(金币+5): 非常感谢指点！ 2011-06-29 20:56:37
qinhy(金币+1): 多谢应助回帖~~~ 2011-07-10 19:45:27
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你可以取一点你的分散液，在上机前在倒置显微镜下看看细胞状态 固定的时候是有沉淀的，这个现象是正常的， PI加药后15min就可以上机检测，最好在1小时内检测完毕，孵育实验太久，因PI的毒性使细胞坏死 Annexin V-PI双染，不用固定，孵育15min直接检测 A549细胞没有做过，不清楚，做周期和凋亡和细胞还是有很大关系的，祝好运 |
2楼2011-06-28 19:56:29
sntyc
木虫 (正式写手)
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3楼2011-06-28 23:55:54
xiajing_acm
新虫 (小有名气)
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4楼2011-06-29 20:59:16
5楼2011-06-30 22:32:34
【答案】应助回帖
★
karl2100(金币+1): 谢谢应助！ 2011-07-10 09:20:48
xiajing_acm(金币+3): 2011-07-11 17:00:40
karl2100(金币+1): 谢谢应助！ 2011-07-10 09:20:48
xiajing_acm(金币+3): 2011-07-11 17:00:40
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1，加药A549细胞消化然后离心，用70%的乙醇固定过夜的，我做的一直都是先加150ul 的PBS，然后再加350ul 的纯乙醇固定，而且滴加纯乙醇的时候要求缓慢滴加，一边滴加一边混匀，这样效果比较好，也从没出现过楼主的问题。 2.细胞在用枪吹散的过程中还应该注意不能太用力，否则细胞破损影响效果。上流式之前，把在流式管中的细胞轻轻的弹起，不能直接把沉底的细胞上流式，这样做还容易把流式堵了。 |
6楼2011-07-10 08:51:31
7楼2011-07-12 20:15:30
mumiandtt
银虫 (小有名气)
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8楼2011-09-24 18:48:35
★
karl2100(金币+1): 多谢指教！ 2011-12-19 23:58:57
karl2100(金币+1): 多谢指教！ 2011-12-19 23:58:57
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流式细胞仪测定细胞周期，细胞固定方法：第一，先用PBS(PH-7.2)讲细胞吹散成但细胞悬液，再加入预冷的无水乙醇（加的时候要分次加入比如加700ul的无水乙醇，我一般分10次加入，每加入一次都要充分混匀），只要保证乙醇的终浓度为70%左右即可；第二，先用PBS将无水乙醇配制成70%的乙醇，然后然管壁将70%的乙醇（预冷的）缓慢加入管中，不要触及细胞沉淀，边加边旋转离心管，加入完毕后，用微量取样器轻轻吹打，一定要轻轻吹打。两种方法皆可。 上机前，用预冷的PBS洗细胞两遍，最后一遍将PBS倒出后，把离心管倒扣在吸水纸上，保证细胞沉淀里无水分，然后染色。 PI染色半小时即可，时间太长细胞碎片会增多。 |
9楼2011-12-19 22:16:33
10楼2013-10-06 21:41:57