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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 有用过pPICZB质粒的虫友吗？
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worm2010

金虫 (小有名气)

[交流] 有用过pPICZB质粒的虫友吗？

正打算最近要转化毕赤酵母，用pPICZB质粒转化。看了毕赤表达手册但是有些问题没搞明白，请各位虫友赐教！

1 转化毕赤（例如GS115），pPICZB是包内表达型的质粒，请问选取表达试剂盒里的对照时应该选哪种质粒进行转化？

2 转化后表型的筛选目的我不是很清楚，为何要筛选表型呢？

3甲醇利用正表型和慢表型哪个用来表达比较好？
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1楼 2011-06-27 13:22:19
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worm2010

金虫 (小有名气)
d顶一顶啊~~
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2楼2011-06-27 15:27:24
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biopanda

铜虫 (小有名气)
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做毕赤酵母很少用胞内表达吧，楼主为什么选择这个？
甲醇利用快慢型实验室中影响不大。
筛选转化子的目的是防止假阳性，以及筛选高拷贝转化子
ABC的差别是酶切位点不同，根据实验需要选取（不能与目的基因含有德尔酶切位点相同），别的没差别。
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3楼2011-06-28 13:06:19
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worm2010

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by biopanda at 2011-06-28 13:06:19:
做毕赤酵母很少用胞内表达吧，楼主为什么选择这个？
甲醇利用快慢型实验室中影响不大。
筛选转化子的目的是防止假阳性，以及筛选高拷贝转化子
ABC的差别是酶切位点不同，根据实验需要选取（不能与目的基因含有 ...

我选这个胞内表达是为了防止目的蛋白被糖基化。重组的目的基因是来自于细菌的
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4楼2011-06-28 19:51:16
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worm2010

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by biopanda at 2011-06-28 13:06:19:
做毕赤酵母很少用胞内表达吧，楼主为什么选择这个？
甲醇利用快慢型实验室中影响不大。
筛选转化子的目的是防止假阳性，以及筛选高拷贝转化子
ABC的差别是酶切位点不同，根据实验需要选取（不能与目的基因含有 ...

我想问，筛选表型的目的，而不是筛选转化子的目的。
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5楼2011-06-28 19:52:49
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biopanda

铜虫 (小有名气)
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Originally posted by worm2010 at 2011-06-28 19:51:16:
我选这个胞内表达是为了防止目的蛋白被糖基化。重组的目的基因是来自于细菌的

那楼主为什么不直接用PET系列载体呢？
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6楼2011-06-28 23:05:18
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worm2010

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by biopanda at 2011-06-28 23:05:18:
那楼主为什么不直接用PET系列载体呢？

呵呵，楼主同时也用了哟~要一起转化一起表达看看表达情况呗
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7楼2011-06-29 08:01:49
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zheng20089829

木虫 (小有名气)
★
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GS115是甲醇利用快速型，KM71H是慢速型，一般要发酵前者用的比较多。每种蛋白也不一样，楼主用胞内的话纯化起来不太方便，可以用Za系列的试试，可以的话会方便很多，如果有糖基化可以用去糖基化酶处理下，不影响活性问题也不大
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8楼2011-06-29 21:54:58
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worm2010

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by zheng20089829 at 2011-06-29 21:54:58:
GS115是甲醇利用快速型，KM71H是慢速型，一般要发酵前者用的比较多。每种蛋白也不一样，楼主用胞内的话纯化起来不太方便，可以用Za系列的试试，可以的话会方便很多，如果有糖基化可以用去糖基化酶处理下，不影响活 ...

那请问表达蛋白是不是筛选正表型的重组菌株来进行表达比较好呢？
我看手册上说因为重组质粒转入毕赤之后可能发生在不同的地方进行交换，交换的地方不同所产生的表型就不同。所以我就不是很明白它上面要求转化完之后有一个表行筛选的过程，目的是什么，是筛正表型进行表达还是筛选出慢表型进行表达。。。。
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9楼2011-06-30 08:59:50
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