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pumpkin236铁虫 (小有名气)
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SIRNA
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各位前辈 我最近开始做基因沉默，沉默的是NIH3T3细胞系的sep15基因，但是用RT-PCR检验发现沉默效率为0，不知道是怎么回事，所以请大家帮我看一下 1 siRNA序列的选择 我参考的是一篇文献，下面 The following Stealth RNA interference (RNAi) duplexes (Invitrogen, Carlsbad, CA) were used: Sep15, UCCUGAGCGAGAAGUUGGAACGCAU; 文献给的是sep15的RNA单链，是不就是给的miRNA序列，（看到一个帖子介绍了miRNA和siRNA的区别，说miRNA是单链，siRNA是双链）？ 我直接按碱基配对原则，配对成了双链的RNA。当做siRNA。让公司合成 但是现在沉默效率为0.不知道是本身siRNA序列合成错误还是其他原因 2 使用的转染试剂是lipo2000 步骤如下 ①① 以合适的密度接种细胞至6孔培养板中，在转染的前一直用10％新生小牛血清而无双抗的DMEM高糖培养液进行培养。当细胞培养到80％融合时，换用无血清无双抗的DMEM高糖培养液培养并进行转染； ②② 对于需要转染的每孔细胞，用250μl的DMEM无血清培养基来稀释5μl的siRNA引物（含siRNA引物的量为100pmol）； ③③ 用250μl的DMEM无血清无双抗培养基来稀释5μl的Lipofectamine2000； ④④ 一旦Lipofectamine2000被DMEM稀释，5分钟内将稀释的siRNA引物（步骤2）和稀释的lipofectamine2000（步骤3）混合均匀，在在室温下孵育20min促使siRNA引物与lipofectamine2000混合物的形成； ⑤⑤ 孵育完成后，直接往每孔中加入siRNA引物与lipofectamine2000混合物500μl，补足无血清培无双抗培养基至2000μl，并轻轻摇晃培养板使其混匀； ⑥⑥ 转染24h后，可检测目的蛋白质的表达或加药进行后续试验。 实验中发现的问题 1转染前细胞状态较好，但是转染后6h去观察，发现有部分细胞死亡，而且背景有很多小黑点，24h观察，有很多成团的漂浮物。死细胞不像，如果是染菌了，但是我操作已经很小心，实验也重复了三次，三次都是到转染后才出发好多漂浮物。 2用RT-PCR检验，沉默效率为0，郁闷死了。大家检验转染效率是用wb，还是PCR 3大家都用的什么转染试剂 4 不知道是不是我的siRNA序列选择错误。siRNA可以用miRNA按照碱基配对方法合成不 在线等答案 谢谢了 |
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lstt09nk(金币+5): 你会的还挺多的么 2011-06-16 22:00:16
pumpkin236(金币+1): 2011-06-26 20:22:25
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pumpkin236(金币+1): 2011-06-26 20:22:26
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siRNA不好做，对于新手可以选择更好控制的shRNA，shRNA是双链DNA构建载体，比较好操作 干扰序列一般要选3段，不建议自己设计，成功率低，你可以到NCBI 的探针库去找，或者查文献找现成的 lipo2000的毒性众所周知，漂细胞也在所难免 ps lipo的假货很多，最好原装 至于检测，RT-PCR需要做荧光定量才行，WB也可以，不过时间点一定要控制好，早了不干扰，晚了干扰过了又回复了，毕竟他不能整合 |
3楼2011-06-15 08:25:36
rb
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给楼主一个做RNA干扰的公司（武汉晶赛）的网址吧，上面有一些做RNA干扰的原理方法：http://www.genesil.com/knowledge.asp?kid=29 另外，我们以前做RNA干扰的时候都是至少设计两条siRNA；再另外，你们做RT-PCR的时候有没有先做一个时间梯度的摸索，其他还木有想到（好久木有做了） |
2楼2011-06-15 07:22:11
rb
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