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pumpkin236

铁虫 (小有名气)

[求助] SIRNA

各位前辈
我最近开始做基因沉默，沉默的是NIH3T3细胞系的sep15基因，但是用RT-PCR检验发现沉默效率为0，不知道是怎么回事，所以请大家帮我看一下
1 siRNA序列的选择
我参考的是一篇文献，下面
The following Stealth RNA interference (RNAi) duplexes (Invitrogen, Carlsbad, CA) were used: Sep15, UCCUGAGCGAGAAGUUGGAACGCAU;
文献给的是sep15的RNA单链，是不就是给的miRNA序列，（看到一个帖子介绍了miRNA和siRNA的区别，说miRNA是单链，siRNA是双链）？

我直接按碱基配对原则，配对成了双链的RNA。当做siRNA。让公司合成
但是现在沉默效率为0.不知道是本身siRNA序列合成错误还是其他原因
2 使用的转染试剂是lipo2000
步骤如下
①① 以合适的密度接种细胞至6孔培养板中，在转染的前一直用10％新生小牛血清而无双抗的DMEM高糖培养液进行培养。当细胞培养到80％融合时，换用无血清无双抗的DMEM高糖培养液培养并进行转染；
②② 对于需要转染的每孔细胞，用250μl的DMEM无血清培养基来稀释5μl的siRNA引物（含siRNA引物的量为100pmol）；
③③ 用250μl的DMEM无血清无双抗培养基来稀释5μl的Lipofectamine2000；
④④ 一旦Lipofectamine2000被DMEM稀释，5分钟内将稀释的siRNA引物（步骤2）和稀释的lipofectamine2000（步骤3）混合均匀，在在室温下孵育20min促使siRNA引物与lipofectamine2000混合物的形成；
⑤⑤ 孵育完成后，直接往每孔中加入siRNA引物与lipofectamine2000混合物500μl，补足无血清培无双抗培养基至2000μl，并轻轻摇晃培养板使其混匀；
⑥⑥ 转染24h后，可检测目的蛋白质的表达或加药进行后续试验。

实验中发现的问题
1转染前细胞状态较好，但是转染后6h去观察，发现有部分细胞死亡，而且背景有很多小黑点，24h观察，有很多成团的漂浮物。死细胞不像，如果是染菌了，但是我操作已经很小心，实验也重复了三次，三次都是到转染后才出发好多漂浮物。

2用RT-PCR检验，沉默效率为0，郁闷死了。大家检验转染效率是用wb，还是PCR

3大家都用的什么转染试剂

4 不知道是不是我的siRNA序列选择错误。siRNA可以用miRNA按照碱基配对方法合成不


在线等答案

谢谢了
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1楼 2011-06-14 17:25:11
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silicare

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
lstt09nk(金币+5): 你会的还挺多的么 2011-06-16 22:00:16
pumpkin236(金币+1): 2011-06-26 20:22:25
pumpkin236(金币+1): 2011-06-26 20:22:26
siRNA不好做，对于新手可以选择更好控制的shRNA，shRNA是双链DNA构建载体，比较好操作

干扰序列一般要选3段，不建议自己设计，成功率低，你可以到NCBI 的探针库去找，或者查文献找现成的

lipo2000的毒性众所周知，漂细胞也在所难免
ps lipo的假货很多，最好原装

至于检测，RT-PCR需要做荧光定量才行，WB也可以，不过时间点一定要控制好，早了不干扰，晚了干扰过了又回复了，毕竟他不能整合
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3楼2011-06-15 08:25:36
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rb

木虫 (著名写手)

小笨虫虫

【答案】应助回帖

★ ★
lstt09nk(金币+2): 感谢参与 2011-06-16 22:00:48
pumpkin236(金币+1): 2011-06-17 13:13:47
pumpkin236(金币+1): 2011-06-26 20:22:32
细胞死亡太多，可能和转染试剂以及细胞状态有关，你应该会做一个阴性的FAM标记的转染对照，看一下在这个过程中转染效率以及siRNA是否稳定，另最好做一个beta－actin siRNA的阳性对照。如果是rt－PCR检测的最好是24-48小时抽提，如果做wb，可以48-72小时抽提。
很久不玩了，只有这些建议。
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寝室楼的大爷、大妈都是哲学家，他们每天都在思考人类最根本的三个问题：你是谁？你从哪儿来？要去哪儿？
4楼2011-06-15 10:21:08
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普通回帖

zhuqiushi

至尊木虫 (正式写手)

Juventus

【答案】应助回帖

★ ★
lstt09nk(金币+2): 热心 2011-06-16 21:59:56
pumpkin236(金币+2): 2011-06-23 16:19:07
pumpkin236(金币+1): 2011-06-26 20:22:17
给楼主一个做RNA干扰的公司（武汉晶赛）的网址吧，上面有一些做RNA干扰的原理方法：http://www.genesil.com/knowledge.asp?kid=29
另外，我们以前做RNA干扰的时候都是至少设计两条siRNA；再另外，你们做RT-PCR的时候有没有先做一个时间梯度的摸索，其他还木有想到（好久木有做了）
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日子就是问题叠着问题，要挺胸抬头去面对
2楼2011-06-15 07:22:11
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rb

木虫 (著名写手)

小笨虫虫
引用回帖:
Originally posted by silicare at 2011-06-15 08:25:36:
siRNA不好做，对于新手可以选择更好控制的shRNA，shRNA是双链DNA构建载体，比较好操作

干扰序列一般要选3段，不建议自己设计，成功率低，你可以到NCBI 的探针库去找，或者查文献找现成的

lipo2000的毒性众所 ...

我用2000好像没有感觉那么大的毒性，细胞是的不多。
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寝室楼的大爷、大妈都是哲学家，他们每天都在思考人类最根本的三个问题：你是谁？你从哪儿来？要去哪儿？
5楼2011-06-15 10:21:59
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spiderboy

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
lstt09nk(金币+2): 感谢分享 2011-06-16 22:01:04
pumpkin236(金币+1): 2011-06-26 20:22:42
1、转染后24H有点少了吧。我们实验室都是2-3天。
2、LIPO毒性大是肯定的。但是不同细胞不太一样。你再看看你的细胞是否很易感。
3、RT和WT都要做，说服力强。
4、最重要的，你设计的SIRNA要用相关软件评估下，参考设计原则，不一定要完全互补配对
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6楼2011-06-16 18:25:44
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pumpkin236

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by rb at 2011-06-15 10:21:08:
细胞死亡太多，可能和转染试剂以及细胞状态有关，你应该会做一个阴性的FAM标记的转染对照，看一下在这个过程中转染效率以及siRNA是否稳定，另最好做一个beta－actin siRNA的阳性对照。如果是rt－PCR检测的最好是2 ...

刚重新做了次，加了转染试剂后24h后去看，发现有好多漂浮物，一团一团的，我感觉不像死细胞，团聚物周围貌似还毛茸茸的，贴壁细胞周围也有一团一团的。是不是染菌了啊？但是感觉操作没问题，不知道是什么原因，头疼死了。。。
谢谢了。。
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7楼2011-06-17 13:16:20
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rb

木虫 (著名写手)

小笨虫虫

【答案】应助回帖

pumpkin236(金币+1): 2011-06-26 20:22:49
如果不是染菌，你可以换液试试。虽然我的实验2000毒性没有那么大，但是脂质体本身还是有有一定的毒性，会造成细胞的死亡的。你可以在转染后4-6小时进行换液，你再看看结果如何？
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寝室楼的大爷、大妈都是哲学家，他们每天都在思考人类最根本的三个问题：你是谁？你从哪儿来？要去哪儿？
8楼2011-06-17 13:39:06
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pumpkin236

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by rb at 2011-06-17 13:39:06:
如果不是染菌，你可以换液试试。虽然我的实验2000毒性没有那么大，但是脂质体本身还是有有一定的毒性，会造成细胞的死亡的。你可以在转染后4-6小时进行换液，你再看看结果如何？

我试过6h后换液，但是第二天去观察时发现，还有好多漂浮的团状物。。是不是就是染菌。。。
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9楼2011-06-17 15:04:07
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pumpkin236

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by zhuqiushi at 2011-06-15 07:22:11:
给楼主一个做RNA干扰的公司（武汉晶赛）的网址吧，上面有一些做RNA干扰的原理方法：http://www.genesil.com/knowledge.asp?kid=29
另外，我们以前做RNA干扰的时候都是至少设计两条siRNA；再另外，你们 ...

我没有摸条件，直接用的实验室常用的条件，一般24-36小时后提取RNA做RT-PCR。
但是第一次做的效果很不好，所以打算在做一次。

摸条件时，是不siRNA：lipo 是不变的？只是同时改变它们的浓度？
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10楼2011-06-23 16:36:27
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