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telomerase

至尊木虫 (著名写手)

cain
我又看到你的贴了
我用lipo的话是2:1（质粒是1）。效率不止是与孔径的大小相关，也与细胞数质粒浓度有关。我不增么做24的，所以不太清楚质粒的量，0.5可能差不多，你买的话，最好看siRNA那家公司的建议，lipo有点大众。
提RNA，如果你Trizol够的话，多加点也无所谓，就是浪费试剂。可以消化下来裂，也可以在孔里裂，这都不是问题。
前面看你问的，估计你的操作不太好。
1、opti-mem（减血清培养基）没有也没关系，用无血清的替代就可以，而且2000不像以前的lipofetine，lipofectamin什么的，他是升级的，有血清也能做，就是此时双抗不好随便加。除非是你细胞的问题，比较难搞，但我也做细胞算是有年头了，这块有没有血清，细胞饥饿不，真不是问题
细胞状态要好，最好是传完18-20h就能张到90%的样子。转染前细胞要换个液。先分别混质粒和2000，然后合并，不要超过20min，均匀滴入。4-6h换液，建议6h，如是全血清的，就不用换了。
2、瞬转最好要72h，他能很好地表达
时间短不推荐。稳定是36h后开始筛选。

另外，siRNA的作用只是down，我看过别的公司的介绍，以前也做过。这个东西，down是你的目的你的结果，有时不用刻意追求那条效率高那条效率低吧，而且很有可能是协同作用。

至于那个软件，我也没办法。还是那个建议，软件的不太可靠，也不一定，祝你顺利！！！！
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我的路靠我的脚踩出来！！！不走寻常路！！！
21楼2012-03-26 20:00:57
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xiaoyugutou

捐助贵宾 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
RT-PCR的结果有时会很不稳定，最好做WB验证，还有siRNA转染时最好做个梯度，这样比较容易找到最适合的有效转染浓度，我以前做过，不是浓度越高越好，低了又没有什么效果，所以最后做个梯度确定下。还有miRNA和siRNA一个是体内的，一个是外源引进的RNA，起作用时都是单链的前体都是双链的
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22楼2012-03-26 23:11:32
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pumpkin236

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2378349楼: Originally posted by xiaoyugutou at 2012-03-26 23:11:32:
RT-PCR的结果有时会很不稳定，最好做WB验证，还有siRNA转染时最好做个梯度，这样比较容易找到最适合的有效转染浓度，我以前做过，不是浓度越高越好，低了又没有什么效果，所以最后做个梯度确定下。还有miRNA和siR ...

如果你提高siRNA浓度，lipo的量会随着提高不？如果lipo不变，siRNA增加，会不会多余的siRNA没有脂质体可结合啊？
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23楼2012-03-27 10:21:39
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pumpkin236

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2378189楼: Originally posted by telomerase at 2012-03-26 20:00:57:
我又看到你的贴了
我用lipo的话是2:1（质粒是1）。效率不止是与孔径的大小相关，也与细胞数质粒浓度有关。我不增么做24的，所以不太清楚质粒的量，0.5可能差不多，你买的话，最好看siRNA那家公司的建议，lipo有点 ...

但是我看trol说明书，说的，trol的量适合孔面积有关，比如6孔板是1ml，那24孔板面积只有1/5，是不trol的量也要变成1/5最好啊。

如果你提高siRNA浓度，lipo的量会随着提高不？如果lipo不变，siRNA增加，会不会多余的siRNA没有脂质体可结合啊？

谢谢了
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24楼2012-03-27 10:23:28
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telomerase

至尊木虫 (著名写手)

cain
lipo的量由质粒决定，如果你确定好了他两的比值的话。
lipo多会损伤细胞，少则浪费质粒，虽然质粒说是也会伤害细胞，但比起lipo差远了

trol这个你不用太纠结，如你试剂够的话，多点无仿，就怕少了，裂的不充分，会讲解RNA
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25楼2012-03-27 11:03:19
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xiaoyugutou

捐助贵宾 (小有名气)
引用回帖:
2378482楼: Originally posted by pumpkin236 at 2012-03-27 10:21:39:
如果你提高siRNA浓度，lipo的量会随着提高不？如果lipo不变，siRNA增加，会不会多余的siRNA没有脂质体可结合啊？

lipo和siRNA之间是按比例加的，你最好看下siRNA的说明，里面应该有用量和与lipo的比例
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26楼2012-03-27 12:11:55
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pumpkin236

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2378189楼: Originally posted by telomerase at 2012-03-26 20:00:57:
我又看到你的贴了
我用lipo的话是2:1（质粒是1）。效率不止是与孔径的大小相关，也与细胞数质粒浓度有关。我不增么做24的，所以不太清楚质粒的量，0.5可能差不多，你买的话，最好看siRNA那家公司的建议，lipo有点 ...

我还想请教下。我用24孔板优化siRNA：lipo的比值，lipo2000上最优的条件是50微升无血清培养基稀释1微升lipo2000.如果我提高lipo的量至2微升，那还用50微升培养基稀释不？还是换成100微升培养基稀释。
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27楼2012-03-28 11:30:05
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telomerase

至尊木虫 (著名写手)

cain
体积不用变也行
最终每孔体积是500微吧
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28楼2012-03-28 11:43:20
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pumpkin236

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2379111楼: Originally posted by telomerase at 2012-03-28 11:43:20:
体积不用变也行
最终每孔体积是500微吧

是的。体积是500微升。24孔板，siRNA：lipo分别为50pmol/2.5μL、50pmol/1.5μL、30pmol/1.5μL.。。。。。大侠，你看如何？
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29楼2012-03-28 14:56:00
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telomerase

至尊木虫 (著名写手)

cain
50pmol/2.5μL、50pmol/1.5μL、30pmol/1.5μL

我没以mol来算过，我都是1微克2微升那样来的。你就以你的这个来呗，看看比例哪个好
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我的路靠我的脚踩出来！！！不走寻常路！！！
30楼2012-03-28 15:13:59
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