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pumpkin236

铁虫 (小有名气)

[求助] SIRNA

各位前辈
我最近开始做基因沉默，沉默的是NIH3T3细胞系的sep15基因，但是用RT-PCR检验发现沉默效率为0，不知道是怎么回事，所以请大家帮我看一下
1 siRNA序列的选择
我参考的是一篇文献，下面
The following Stealth RNA interference (RNAi) duplexes (Invitrogen, Carlsbad, CA) were used: Sep15, UCCUGAGCGAGAAGUUGGAACGCAU;
文献给的是sep15的RNA单链，是不就是给的miRNA序列，（看到一个帖子介绍了miRNA和siRNA的区别，说miRNA是单链，siRNA是双链）？

我直接按碱基配对原则，配对成了双链的RNA。当做siRNA。让公司合成
但是现在沉默效率为0.不知道是本身siRNA序列合成错误还是其他原因
2 使用的转染试剂是lipo2000
步骤如下
①① 以合适的密度接种细胞至6孔培养板中，在转染的前一直用10％新生小牛血清而无双抗的DMEM高糖培养液进行培养。当细胞培养到80％融合时，换用无血清无双抗的DMEM高糖培养液培养并进行转染；
②② 对于需要转染的每孔细胞，用250μl的DMEM无血清培养基来稀释5μl的siRNA引物（含siRNA引物的量为100pmol）；
③③ 用250μl的DMEM无血清无双抗培养基来稀释5μl的Lipofectamine2000；
④④ 一旦Lipofectamine2000被DMEM稀释，5分钟内将稀释的siRNA引物（步骤2）和稀释的lipofectamine2000（步骤3）混合均匀，在在室温下孵育20min促使siRNA引物与lipofectamine2000混合物的形成；
⑤⑤ 孵育完成后，直接往每孔中加入siRNA引物与lipofectamine2000混合物500μl，补足无血清培无双抗培养基至2000μl，并轻轻摇晃培养板使其混匀；
⑥⑥ 转染24h后，可检测目的蛋白质的表达或加药进行后续试验。

实验中发现的问题
1转染前细胞状态较好，但是转染后6h去观察，发现有部分细胞死亡，而且背景有很多小黑点，24h观察，有很多成团的漂浮物。死细胞不像，如果是染菌了，但是我操作已经很小心，实验也重复了三次，三次都是到转染后才出发好多漂浮物。

2用RT-PCR检验，沉默效率为0，郁闷死了。大家检验转染效率是用wb，还是PCR

3大家都用的什么转染试剂

4 不知道是不是我的siRNA序列选择错误。siRNA可以用miRNA按照碱基配对方法合成不


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谢谢了
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1楼 2011-06-14 17:25:11
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telomerase

至尊木虫 (著名写手)

cain
我又看到你的贴了
我用lipo的话是2:1（质粒是1）。效率不止是与孔径的大小相关，也与细胞数质粒浓度有关。我不增么做24的，所以不太清楚质粒的量，0.5可能差不多，你买的话，最好看siRNA那家公司的建议，lipo有点大众。
提RNA，如果你Trizol够的话，多加点也无所谓，就是浪费试剂。可以消化下来裂，也可以在孔里裂，这都不是问题。
前面看你问的，估计你的操作不太好。
1、opti-mem（减血清培养基）没有也没关系，用无血清的替代就可以，而且2000不像以前的lipofetine，lipofectamin什么的，他是升级的，有血清也能做，就是此时双抗不好随便加。除非是你细胞的问题，比较难搞，但我也做细胞算是有年头了，这块有没有血清，细胞饥饿不，真不是问题
细胞状态要好，最好是传完18-20h就能张到90%的样子。转染前细胞要换个液。先分别混质粒和2000，然后合并，不要超过20min，均匀滴入。4-6h换液，建议6h，如是全血清的，就不用换了。
2、瞬转最好要72h，他能很好地表达
时间短不推荐。稳定是36h后开始筛选。

另外，siRNA的作用只是down，我看过别的公司的介绍，以前也做过。这个东西，down是你的目的你的结果，有时不用刻意追求那条效率高那条效率低吧，而且很有可能是协同作用。

至于那个软件，我也没办法。还是那个建议，软件的不太可靠，也不一定，祝你顺利！！！！
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我的路靠我的脚踩出来！！！不走寻常路！！！
21楼2012-03-26 20:00:57
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zhuqiushi

至尊木虫 (正式写手)

Juventus

【答案】应助回帖

★ ★
lstt09nk(金币+2): 热心 2011-06-16 21:59:56
pumpkin236(金币+2): 2011-06-23 16:19:07
pumpkin236(金币+1): 2011-06-26 20:22:17
给楼主一个做RNA干扰的公司（武汉晶赛）的网址吧，上面有一些做RNA干扰的原理方法：http://www.genesil.com/knowledge.asp?kid=29
另外，我们以前做RNA干扰的时候都是至少设计两条siRNA；再另外，你们做RT-PCR的时候有没有先做一个时间梯度的摸索，其他还木有想到（好久木有做了）
赞一下(2人) 回复此楼
日子就是问题叠着问题，要挺胸抬头去面对
2楼2011-06-15 07:22:11
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silicare

荣誉版主 (文坛精英)

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优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
lstt09nk(金币+5): 你会的还挺多的么 2011-06-16 22:00:16
pumpkin236(金币+1): 2011-06-26 20:22:25
pumpkin236(金币+1): 2011-06-26 20:22:26
siRNA不好做，对于新手可以选择更好控制的shRNA，shRNA是双链DNA构建载体，比较好操作

干扰序列一般要选3段，不建议自己设计，成功率低，你可以到NCBI 的探针库去找，或者查文献找现成的

lipo2000的毒性众所周知，漂细胞也在所难免
ps lipo的假货很多，最好原装

至于检测，RT-PCR需要做荧光定量才行，WB也可以，不过时间点一定要控制好，早了不干扰，晚了干扰过了又回复了，毕竟他不能整合
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3楼2011-06-15 08:25:36
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rb

木虫 (著名写手)

小笨虫虫

【答案】应助回帖

★ ★
lstt09nk(金币+2): 感谢参与 2011-06-16 22:00:48
pumpkin236(金币+1): 2011-06-17 13:13:47
pumpkin236(金币+1): 2011-06-26 20:22:32
细胞死亡太多，可能和转染试剂以及细胞状态有关，你应该会做一个阴性的FAM标记的转染对照，看一下在这个过程中转染效率以及siRNA是否稳定，另最好做一个beta－actin siRNA的阳性对照。如果是rt－PCR检测的最好是24-48小时抽提，如果做wb，可以48-72小时抽提。
很久不玩了，只有这些建议。
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寝室楼的大爷、大妈都是哲学家，他们每天都在思考人类最根本的三个问题：你是谁？你从哪儿来？要去哪儿？
4楼2011-06-15 10:21:08
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