【答案】应助回帖

11楼2011-06-23 16:37:23

zhuqiushi

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【答案】应助回帖

pumpkin236(金币+1): 2011-06-26 20:23:04

引用回帖:

Originally posted by pumpkin236 at 2011-06-23 16:36:27:
我没有摸条件，直接用的实验室常用的条件，一般24-36小时后提取RNA做RT-PCR。
但是第一次做的效果很不好，所以打算在做一次。

摸条件时，是不siRNA：lipo 是不变的？只是同时改变它们的浓度？

我们做的RNA干扰是把稀释后的siRNA直接注射进活体动物的特定组织后，过6、12、24、36、48、60、72、84、96h后从该组织处提取RNA进行RT-PCR检测然后再以对照组做比较来检测RNA干扰的效率（快2年没做了，大概是这么个过程），我们没有在细胞水平做过，所以对于细胞转染时的条件摸索我不大清楚

日子就是问题叠着问题，要挺胸抬头去面对

12楼2011-06-24 12:59:09

pumpkin236

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Originally posted by silicare at 2011-06-15 08:25:36:
siRNA不好做，对于新手可以选择更好控制的shRNA，shRNA是双链DNA构建载体，比较好操作

干扰序列一般要选3段，不建议自己设计，成功率低，你可以到NCBI 的探针库去找，或者查文献找现成的

lipo2000的毒性众所 ...

我做了块两个月了，老出问题。转染后4h换液后，过一段时间就有好多漂浮物，不像死细胞，倒像是染菌。但是已经排除是培养基的问题。不知道你遇到过这种问题么。。

谢谢了。。。

13楼2011-06-27 09:27:33

silicare

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引用回帖:

Originally posted by pumpkin236 at 2011-06-27 09:27:33:
我做了块两个月了，老出问题。转染后4h换液后，过一段时间就有好多漂浮物，不像死细胞，倒像是染菌。但是已经排除是培养基的问题。不知道你遇到过这种问题么。。

谢谢了。。。

怎么判断是染菌？

怎么排除的培养基问题？

14楼2011-06-27 11:59:30

pumpkin236

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Originally posted by silicare at 2011-06-27 11:59:30:
怎么判断是染菌？

怎么排除的培养基问题？

我把所使用的培养基放到培养皿中培养没发现异常。而且转染几小时候发现飘起来的好多一团一团的东西，而且时间越久越多，我4h后换液再培养还是会出现类似情况。并且正常组也会出现同样的情况（对照组转染时，正常组也换成了无血清的培养基）。同时我用喊5%血清的培养基培养细胞就不会出现类似情况。

现在很头疼，不知道什么问题，想的是不是因为转染时候用的无血清培养基细胞受不了，但是如果换含血清的培养基，又不利于转染。。。。

15楼2011-06-27 16:59:17

silicare

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【答案】应助回帖

这种情况就需要你多做对照排除原因了
不过还是首先要怀疑毒性
污染的概率不大，即便污染也不会是你看到的情况

做个只有lipo的对照
做个只有质粒的对照，看看内毒素情况，虽然这种概率很低很低
6孔板转染的话2-3ul lipo也能得到很好的转染效果，你甚至可以试试1ul

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pumpkin236

16楼2011-06-27 17:11:52

pumpkin236

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引用回帖:

Originally posted by silicare at 2011-06-27 17:11:52:
这种情况就需要你多做对照排除原因了
不过还是首先要怀疑毒性
污染的概率不大，即便污染也不会是你看到的情况

做个只有lipo的对照
做个只有质粒的对照，看看内毒素情况，虽然这种概率很低很低
6孔板转染的 ...

太感谢你了。。下午实验我就试一下。。谢谢了

17楼2011-06-28 09:15:56

spiderboy

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Originally posted by zhuqiushi at 2011-06-24 12:59:09:
我们做的RNA干扰是把稀释后的siRNA直接注射进活体动物的特定组织后，过6、12、24、36、48、60、72、84、96h后从该组织处提取RNA进行RT-PCR检测然后再以对照组做比较来检测RNA干扰的效率（快2年没做了，大概是这 ...

要确定是否染菌，你可以做下DAPI染色和革兰氏染色。另外，可以取一点你的培养产物放在LB平板上，看看是否长。

18楼2011-06-28 12:19:48

zhenzhen2050

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【答案】应助回帖

设计siRNA要考虑很多因素，比如是否和合适的位点配对，不能和种子序列配对，不能和靠近两端的序列配对，否则都会影响沉默效率。
设计的siRNA末端可以加两个T,以增加结合的稳定性。
具体设计siRNA的的注意事项文献中都有。
转染时的无菌操作也各种小心吧，其中混合要均匀，时间有要求的一定要严格。
我也是用的同样的转染试剂，效果挺好的，
lz加油吧~

19楼2011-06-28 12:53:59

pumpkin236

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1212380楼: Originally posted by spiderboy at 2011-06-16 18:25:44:
1、转染后24H有点少了吧。我们实验室都是2-3天。
2、LIPO毒性大是肯定的。但是不同细胞不太一样。你再看看你的细胞是否很易感。
3、RT和WT都要做，说服力强。
4、最重要的，你设计的SIRNA要用相关软件评估下， ...

你好，以前请教过你siRNA的问题，最近又遇到问题想问下，最近买的dramcom现成的siRNA，发现24h，按lipo推荐的比例，发现沉默效果几乎没有。想摸下lipo：siRNA的比例。
1 想问下，摸条件的时候，如果用24孔板，比较省试剂，但是如果做RT-PCR，24孔板怎么提RNA呢。我手上的步骤都是6孔板的提RNA的相关步骤
2 我买的siRNA试剂的时候，是四条siRNA混合装的，给了四条siRNA的序列。但是我想选出两条最优的让试剂公司给合成。你知道哪个软件可以筛选siRNA序列不？

20楼2012-03-26 16:59:22