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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求助水稻叶片DNA的提取方法
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苹果晒太阳

新虫 (小有名气)

[求助] 求助水稻叶片DNA的提取方法

最近在提水稻叶片DNA，用的是简化法，提完了，却一直P不出目的条带。有看到一篇文献说若用此法提DNA，则片段较大的条带P不出来。不知道各位有没有好的快速的提取水稻叶片DNA的方法？

简化法步骤如下：1、取水稻叶片20mg，液氮研磨，加入500ul预冷的DNA提取液（ 0.1M Tris-HCl（PH8.0），0.5M NaCl  ， 0.05M EDTA ），煮沸5min。13000rpm离心10min。
2、吸取400ul上清液至新的离心管，加入1/10体积醋酸钠（3mol/L）和2倍体积无水乙醇，上下颠倒混匀，13000rpm离心5min。
3、倒掉上清液，加入500ul 70%乙醇，13000rpm离心2min。
4、倒掉上清液，将离心管放于超净台中吹干乙醇。
5、加入TE溶解DNA。
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1楼 2011-06-08 20:44:36
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wwling

铜虫 (小有名气)
★
silicare(金币+1): 2011-06-09 12:23:28
提的DNA有没有做检测呢？量和纯度怎样？
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3楼2011-06-08 22:37:28
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苹果晒太阳

新虫 (小有名气)
引物没有问题，PCR程序也没问题。阳性对照一直都可以P出来。
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2楼2011-06-08 20:47:26
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苹果晒太阳

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by wwling at 2011-06-08 22:37:28:
提的DNA有没有做检测呢？量和纯度怎样？

提完跑了电泳，DNA条带与mark相比，稍微暗一点。杂质比较多。
用这些DNA做了PCR，其中一个500bp左右的目的基因可以P出来，另一个1000bp左右的总是没法P出来。
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4楼2011-06-09 13:01:45
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adslye

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
苹果晒太阳(金币+2): 2011-06-15 21:04:57
lstt09nk(金币+8, BioEPI+1): good 2011-09-27 16:59:37
植物叶片一般含有很高的次生代谢产物。特别一些成熟的组织，次生代谢丰富，多酚多糖含量很高。传统的提取方法会被干扰。
我们实验室用的CTAB法。对于次生代谢丰富的组织的RNA,DNA都有很好的效果。

试剂配制：  2xCTAB提取液 :  CTAB2g/100ml 其余按浓度配  1.4M Nacl , 20mM EDTA， 100mM Tris ，调PH=8 。可以加2%的PVP,和1% b巯基乙醇（抗氧化）。
步骤：
1.适当的组织用液氮研磨后加入提取液。（我们一般1.5EP管，加1ml 0.5g组织，但这个可以自己增减）60°水浴半小时。
2.离心取上清8000rpm,2mins。
3.上清酚氯仿1-2遍
4.氯仿处理一遍
5，异丙醇或乙醇配合NaAc沉淀。

个人经验：以上步骤中1可以不煮，2可以省略，东西干净的话3可以只一遍。所有离心可以用12000rpm ,5mins。

这个方法也可用于植物的RNA提取，酚氯仿换酸性的就好。
另外提示下，纯净的DNA应该是透明的，一般PCR没影响，当需要酶切的时候就能感觉到纯净的DNA明显好切。
祝实验顺利。
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5楼2011-06-09 13:18:38
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