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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 巢式PCR
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睡着数绵羊

银虫 (小有名气)

[求助] 巢式PCR

最近一直在用巢式P可是做了很久就没有结果，想请教下，用巢式P要注意些什么
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1楼 2011-06-07 14:17:14
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juliana_zou11

木虫 (著名写手)
巢式很好做啊，是怎么没有结果呢
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2楼2011-06-07 14:22:56
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睡着数绵羊

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by juliana_zou11 at 2011-06-07 14:22:56:
巢式很好做啊，是怎么没有结果呢

摸了很多梯度，可第2轮就是不出结果，是为什么那？要注意些什么，是我做的温度不合适吗？
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3楼2011-06-07 14:29:35
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juliana_zou11

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
睡着数绵羊(金币+1): 2011-06-07 14:43:56
lstt09nk(金币+2): 感谢参与，欢迎再来 2011-06-12 19:18:07
以下仅供参考：
1.第一轮产物电泳确定下是不是目的的
2.第二轮引物确定有没有出问题
3.PCR体系是什么样的，有没有出什么问题，如果前面两个都没问题，这里肯定需要优化，温度不能决定一切
4.实在不行用个梯度PCR试试
5.第一轮产物纯化一下再做第二轮试试
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4楼2011-06-07 14:36:22
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睡着数绵羊

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by juliana_zou11 at 2011-06-07 14:36:22:
以下仅供参考：
1.第一轮产物电泳确定下是不是目的的
2.第二轮引物确定有没有出问题
3.PCR体系是什么样的，有没有出什么问题，如果前面两个都没问题，这里肯定需要优化，温度不能决定一切
4.实在不行用个梯度 ...

1,前面几次做的时候第一轮出了非特异性条带，紧接着做第2轮，温度也条了很多，还是没有结果，后面就是重复第1轮的条件，杂带也不出了。
2,反应体系：
taq plus mix        25
pri.mix(10μM)     1.8
template(700ng/μl)    1.8
h2o                  21.4
total                 50
差不多所有温度都做了。
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5楼2011-06-07 14:43:30
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juliana_zou11

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

taq plus mix        这个是？taq和dNTP呢？
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6楼2011-06-07 14:49:23
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睡着数绵羊

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by juliana_zou11 at 2011-06-07 14:49:23:
taq plus mix        这个是？taq和dNTP呢？

这个是种混合酶，里面都是加好的，整个体系只要加模板和引物就可以了。
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7楼2011-06-08 09:12:47
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juliana_zou11

木虫 (著名写手)
做PCR有些时候是很邪门的，同样的条件有的人能做出来有的人做不出来，有时候今天能做出来明天做不出来，我们以前遇到这种情况有时会换个人做，有时会放一段时间再做，如果非做不可那就换个体系，换个酶试试看
还有第一轮的产物有没有经过什么处理?
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8楼2011-06-08 12:54:31
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睡着数绵羊

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by juliana_zou11 at 2011-06-08 12:54:31:
做PCR有些时候是很邪门的，同样的条件有的人能做出来有的人做不出来，有时候今天能做出来明天做不出来，我们以前遇到这种情况有时会换个人做，有时会放一段时间再做，如果非做不可那就换个体系，换个酶试试看
还 ...

做第2轮的时候就是稀释了下模板~~
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9楼2011-06-09 13:47:22
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adslye

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

睡着数绵羊(金币+1): 2011-06-11 15:20:05
引用回帖:
Originally posted by 睡着数绵羊 at 2011-06-09 13:47:22:
做第2轮的时候就是稀释了下模板~~

是高保真酶吗？
换高保真酶看看。可能第一轮的产物是非特异性产物。
引物OK吗？
是自己设计的，还是网上下的。不管怎样确认下。
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10楼2011-06-10 21:48:23
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