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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » Western blot中出现的问题-求高手指点
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liujie2008

金虫 (小有名气)

[求助] Western blot中出现的问题-求高手指点

我做Western blot，考染的结果很好，转膜的时候用的是180mA，转了1.5h，10%脱脂奶粉TTBS封闭4h，一抗1:1500 4°过夜，TTBS洗三遍，每次5Min，二抗1:800，室温2h，TTBS洗三遍，每次5Min，TBS洗一遍5min，然后加的显色剂，怎么膜上没有条带呢？做了两次了，第一次的时候什么都没有，膜背景很干净，第二次背景很脏，明显的没有封闭好的样子，但是方法都是一样的，怎么这样呢？一点带都没有，我用的是PVDF膜，求高手指点
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认真做好每一天
1楼 2011-05-25 00:10:16
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396101466

金虫 (正式写手)

一段遗失的美好
★ ★
silicare(金币+2): 谢谢参与 2011-06-03 18:27:14
首先要膜的预处理是否正确；第二确定转膜是膜和胶的顺序没有错；第三，我有点儿质疑楼主的转膜条件，180mA，1.5h，我们实验室的条件是50mA，转膜1h，你的时间太长电流也大，有可能蛋白穿过膜。还有，maker在转膜后怎么样？
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人生的三大悲剧：不知道选择，不坚持选择，不断选择！
15楼2011-06-02 15:16:36
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烂铁

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我也是新手，帮你顶一下。
为什么你的封闭液是10%的脱脂奶粉而不是5%呢？另外显色过程是不是要避光的啊？
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看见你开心我会不禁微笑，想起你伤心我会暗暗心疼。
2楼2011-05-29 16:12:39
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chysx6

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

liujie2008(金币+1): 2011-05-30 21:45:51
180mA，转了1.5h???

半干转？请确认正确的操作方法及时间
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3楼2011-05-30 00:46:25
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黄大牛

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

liujie2008(金币+4): 2011-05-30 21:49:34
半干转： 22v 30min，10%脱脂牛奶block30min，TBST清洗，一抗1：1000一小时，TBST清洗3次，10min/次。二抗1:3000一小时，TBST清洗3次，10min/次，显色。效果不错
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朝为田舍郎，暮登天子堂。将相本无种，男儿当自强。
4楼2011-05-30 15:53:38
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