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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » Western blot中出现的问题-求高手指点
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liujie2008

金虫 (小有名气)

[求助] Western blot中出现的问题-求高手指点

我做Western blot，考染的结果很好，转膜的时候用的是180mA，转了1.5h，10%脱脂奶粉TTBS封闭4h，一抗1:1500 4°过夜，TTBS洗三遍，每次5Min，二抗1:800，室温2h，TTBS洗三遍，每次5Min，TBS洗一遍5min，然后加的显色剂，怎么膜上没有条带呢？做了两次了，第一次的时候什么都没有，膜背景很干净，第二次背景很脏，明显的没有封闭好的样子，但是方法都是一样的，怎么这样呢？一点带都没有，我用的是PVDF膜，求高手指点
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认真做好每一天
1楼 2011-05-25 00:10:16
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烂铁

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我也是新手，帮你顶一下。
为什么你的封闭液是10%的脱脂奶粉而不是5%呢？另外显色过程是不是要避光的啊？
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看见你开心我会不禁微笑，想起你伤心我会暗暗心疼。
2楼2011-05-29 16:12:39
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chysx6

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

liujie2008(金币+1): 2011-05-30 21:45:51
180mA，转了1.5h???

半干转？请确认正确的操作方法及时间
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3楼2011-05-30 00:46:25
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黄大牛

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

liujie2008(金币+4): 2011-05-30 21:49:34
半干转： 22v 30min，10%脱脂牛奶block30min，TBST清洗，一抗1：1000一小时，TBST清洗3次，10min/次。二抗1:3000一小时，TBST清洗3次，10min/次，显色。效果不错
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朝为田舍郎，暮登天子堂。将相本无种，男儿当自强。
4楼2011-05-30 15:53:38
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冬虫夏草1

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

转膜方法欠妥，确定放置顺序没错？另外探针制作效果可能不佳
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倚楼听风雨，淡看江湖路！
5楼2011-05-30 18:09:41
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liujie2008

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by chysx6 at 2011-05-30 00:46:25:
180mA，转了1.5h???

半干转？请确认正确的操作方法及时间

我用的是湿转，180mA 1.5个小时，但是没有转出来
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认真做好每一天
6楼2011-05-30 21:46:43
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liujie2008

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by chysx6 at 2011-05-30 00:46:25:
180mA，转了1.5h???

半干转？请确认正确的操作方法及时间

我的目的蛋白是55KD，想用湿转法，求高手指点，稳压的话多少合适？时间多少？稳流的应该是多少啊？谢谢了啊
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认真做好每一天
7楼2011-05-30 21:48:54
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liujie2008

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 黄大牛 at 2011-05-30 15:53:38:
半干转： 22v 30min，10%脱脂牛奶block30min，TBST清洗，一抗1：1000一小时，TBST清洗3次，10min/次。二抗1:3000一小时，TBST清洗3次，10min/次，显色。效果不错

半干转和湿转的方法不一样吧，我的目的蛋白是55KD，也是用22V,30min吗？顺便问一下一抗、二抗能重复使用吗？
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认真做好每一天
8楼2011-05-30 21:51:23
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liujie2008

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 冬虫夏草1 at 2011-05-30 18:09:41:
转膜方法欠妥，确定放置顺序没错？另外探针制作效果可能不佳

顺序没有错，这个确定，不知道在转膜上怎么改进好呢？我的目的蛋白是55KD的，求高手指点迷津
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认真做好每一天
9楼2011-05-30 21:53:11
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liujie2008

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 冬虫夏草1 at 2011-05-30 18:09:41:
转膜方法欠妥，确定放置顺序没错？另外探针制作效果可能不佳

还想问一下我今天用稳压80V转膜试了一下，一开始的半个小时还是80V，但是随着时间的延长，电压逐渐降低，最后到了56V了，等我转了2个小时后，转膜液和仪器直接特别烫，不知道应该怎么解决啊？
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认真做好每一天
10楼2011-05-30 21:56:28
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