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liujie2008

金虫 (小有名气)

[求助] Western blot中出现的问题-求高手指点

我做Western blot,考染的结果很好,转膜的时候用的是180mA,转了1.5h,10%脱脂奶粉TTBS封闭4h,一抗1:1500 4°过夜,TTBS洗三遍,每次5Min,二抗1:800,室温2h,TTBS洗三遍,每次5Min,TBS洗一遍5min,然后加的显色剂,怎么膜上没有条带呢?做了两次了,第一次的时候什么都没有,膜背景很干净,第二次背景很脏,明显的没有封闭好的样子,但是方法都是一样的,怎么这样呢?一点带都没有,我用的是PVDF膜,求高手指点
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黄大牛

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

liujie2008(金币+4): 2011-05-30 21:49:34
半干转: 22v 30min,10%脱脂牛奶block30min,TBST清洗,一抗1:1000一小时,TBST清洗3次,10min/次。二抗1:3000一小时,TBST清洗3次,10min/次,显色。效果不错
朝为田舍郎,暮登天子堂。将相本无种,男儿当自强。
4楼2011-05-30 15:53:38
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烂铁

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我也是新手,帮你顶一下。
为什么你的封闭液是10%的脱脂奶粉而不是5%呢?另外显色过程是不是要避光的啊?
看见你开心我会不禁微笑,想起你伤心我会暗暗心疼。
2楼2011-05-29 16:12:39
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chysx6

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

liujie2008(金币+1): 2011-05-30 21:45:51
180mA,转了1.5h???

半干转?请确认正确的操作方法及时间
3楼2011-05-30 00:46:25
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冬虫夏草1

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

转膜方法欠妥,确定放置顺序没错?另外探针制作效果可能不佳
倚楼听风雨,淡看江湖路!
5楼2011-05-30 18:09:41
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