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老实人sdu3375

木虫 (正式写手)

[求助] Ni柱分离纯化6His标签重组蛋白

本人用镍柱分离带有6个组氨酸标签的重组蛋白,缓冲液是20mM磷酸三钠、500mM氯化钠、10mM咪唑,洗脱缓冲液是250mM咪唑。经过几次层析后发现:我的目的蛋白都穿透了,没有挂住。。。请问大家,这是怎么回事呢?该咋办呢?谢谢!
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秋叶漫漫

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


karl2100(金币+1): 谢谢! 2011-05-09 19:05:52
老实人sdu3375(金币+2): 2011-05-12 10:17:32
我没理解你的穿透是哪种意思,呵呵
1,如果是250mM咪唑的洗脱液将你的蛋白洗脱下来的,这是正常的,250的咪唑就是为了洗脱蛋白
2,在10mM的情况下,蛋白就下来了,如果你的测序是正确的,那可能是蛋白的立体结构使His标签没有完全暴露在外,与Ni结合不紧密。
一只小笨鸟,飞呀飞呀飞~
2楼2011-05-09 01:02:56
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老实人sdu3375

木虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by 秋叶漫漫 at 2011-05-09 01:02:56:
我没理解你的穿透是哪种意思,呵呵
1,如果是250mM咪唑的洗脱液将你的蛋白洗脱下来的,这是正常的,250的咪唑就是为了洗脱蛋白
2,在10mM的情况下,蛋白就下来了,如果你的测序是正确的,那可能是蛋白的立体结构 ...

嗯,您说的这种情况很可能发生。那是不是也有可能和填料有关呢?
3楼2011-05-09 09:10:05
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秋叶漫漫

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

老实人sdu3375(金币+3): 2011-05-12 10:17:39
引用回帖:
Originally posted by 老实人sdu3375 at 2011-05-09 09:10:05:
嗯,您说的这种情况很可能发生。那是不是也有可能和填料有关呢?

可能与Ni柱的载样量有关系,只能挂住一定量的蛋白,剩下的都透过去了。
你们实验室还有人用Ni柱吗?问问他们载样量多大吧。
一只小笨鸟,飞呀飞呀飞~
4楼2011-05-09 16:31:10
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老实人sdu3375

木虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by 秋叶漫漫 at 2011-05-09 16:31:10:
可能与Ni柱的载样量有关系,只能挂住一定量的蛋白,剩下的都透过去了。
你们实验室还有人用Ni柱吗?问问他们载样量多大吧。

我用的是Chelating Sepharose Fast Flow,不知道这个填料怎么样啊?吸附效果是不是不是很好呢?
5楼2011-05-10 09:55:18
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xhjggl

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

Chelating Sepharose Fast Flow哪个公司的?上海生工的停好用的.
6楼2011-05-10 14:47:53
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秋叶漫漫

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by 老实人sdu3375 at 2011-05-10 09:55:18:
我用的是Chelating Sepharose Fast Flow,不知道这个填料怎么样啊?吸附效果是不是不是很好呢?

呵呵,不同公司的填料吸附性是有差别的,你的不知道是哪个公司的?最好还是自己试一下,或者,问问别人的经验。呵呵
一只小笨鸟,飞呀飞呀飞~
7楼2011-05-10 19:53:05
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老实人sdu3375

木虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by xhjggl at 2011-05-10 14:47:53:
Chelating Sepharose Fast Flow哪个公司的?上海生工的停好用的.

呵呵……GE的~~您用过么?
8楼2011-05-10 22:10:09
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老实人sdu3375

木虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by 秋叶漫漫 at 2011-05-10 19:53:05:
呵呵,不同公司的填料吸附性是有差别的,你的不知道是哪个公司的?最好还是自己试一下,或者,问问别人的经验。呵呵

呵呵……GE的。不知道怎么样呢?
9楼2011-05-10 22:10:34
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秋叶漫漫

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by 老实人sdu3375 at 2011-05-10 22:10:34:
呵呵……GE的。不知道怎么样呢?

呵呵,没用过这家的,大公司的说明书比较可信,你看看说明书上对吸附量的描述吧,它写多少,就是多少。
一只小笨鸟,飞呀飞呀飞~
10楼2011-05-11 03:13:54
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