应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » DGGE上样孔很亮，DNA跑不下来
131/2返回列表12下一页
查看: 2761  |  回复: 12
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

yujijiang

铜虫 (初入文坛)

[求助] DGGE上样孔很亮，DNA跑不下来

最近在做氨氧化细菌的生物多样性，我扩增了amoA的基因特异性很好，条带单一，但是做DGGE时好多跑不出孔，已经尝试了很多次，情况依旧。请各位大虾给小弟指点迷津。。。万分感谢！
DGGE的条件：6%的胶，变性梯度是30-60%，没有堆积胶，上样前PCR产物为纯化，上样前会将孔冲洗一下，电泳时间90V，13h。
我灌胶是做的0%和100%的母液，灌胶时高低浓度为14毫升，加入100微升APS和9微升的TEMED。
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2011-05-05 11:40:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

在雨中

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
lstt09nk(金币+3): 感谢交流，欢迎常来 2011-05-05 18:22:07
我做过Archaea 的amoA基因的DGGE，效果很好。
细菌的amoA基因的DGGE没做过。呵呵。
Archaeal amoA genes were amplified using primers CrenamoA-23f and CrenamoA-616r without the requirement of a GC clamp.
Archaeal amoA gene DGGE protocol: 0.75-mm-thick 8% (w/v) polyacrylamide gels, 15% to 60%,Gels were electrophoresed in 1 × TAE buffer at 60 °C for 14 h at 90 V.
楼主可以将你的引物序列，名称，PCR程序贴出来看看
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2011-05-05 12:26:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

冬虫夏草1

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

yujijiang(金币+1): 2011-05-05 13:31:18
你做的应该是SDS-PAGE电泳吧！
若是，请确定PAGE胶浓度与蛋白分子量关系，6%的胶不一定合适，做梯度吧，多尝试！
你说的“没有堆积胶”是指浓缩胶吧，一般都要的。
赞一下 回复此楼
倚楼听风雨，淡看江湖路！
3楼2011-05-05 13:00:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yujijiang

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by 在雨中 at 2011-05-05 12:26:30:
我做过Archaea 的amoA基因的DGGE，效果很好。
细菌的amoA基因的DGGE没做过。呵呵。
Archaeal amoA genes were amplified using primers CrenamoA-23f and CrenamoA-616r without the requirement of a GC clamp ...

首先感谢你的回帖，呵呵。。。我在
想是否是30%的梯度仍然太高了，以至于无法跑下来呢？
赞一下 回复此楼
4楼2011-05-05 13:34:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yujijiang

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by 冬虫夏草1 at 2011-05-05 13:00:00:
你做的应该是SDS-PAGE电泳吧！
若是，请确定PAGE胶浓度与蛋白分子量关系，6%的胶不一定合适，做梯度吧，多尝试！
你说的“没有堆积胶”是指浓缩胶吧，一般都要的。

我做的不是SDS-PAGE，是DGGE，是做微生物多态性的，跟蛋白质无关。。。还是感谢你的回帖。。。呵呵
赞一下 回复此楼
5楼2011-05-05 13:35:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

在雨中

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
lstt09nk(金币+5): 热心 2011-05-05 18:22:27
引用回帖:
Originally posted by yujijiang at 2011-05-05 13:34:01:
首先感谢你的回帖，呵呵。。。我在
想是否是30%的梯度仍然太高了，以至于无法跑下来呢？

文献中对细菌的amoA基因的DGGE操作条件，30-70%变化梯度用的比较多，也有40-60%的梯度。所以你实验中的操作条件应当合适的。
对了，你的引物是amoA-1F和amoA-2R吧？文献报道较多的那对？加上GC夹子扩增很难得呀，你这么容易就扩增出来了。。。。

如果我做的DGGE图如你所贴，我会把胶重新做一遍，尤其是0%和100%的胶重新配。还有，你的PCR产物如果效果很好的话，大可不必进行纯化也可进行DGGE，因为有的PCR产物纯化试剂盒纯化效果很差，会把PCR片段搞断裂，弥散，也许你纯化后可以走一次琼脂糖胶看看纯化后的效果。
赞一下(1人) 回复此楼
6楼2011-05-05 14:32:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yujijiang

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by 在雨中 at 2011-05-05 14:32:39:
文献中对细菌的amoA基因的DGGE操作条件，30-70%变化梯度用的比较多，也有40-60%的梯度。所以你实验中的操作条件应当合适的。
对了，你的引物是amoA-1F和amoA-2R吧？文献报道较多的那对？加上GC夹子扩增很难得 ...

我用的引物是amoA-1F-GC和amoA-2R。。。。用的是类似巢式PCR进行两轮扩增的。
另外，我配0%和100%的母液时都会过一下milipore的0.22um滤膜,因为母液在冰箱中放置一段时间后出现絮状的沉淀。。。。是否过膜也会有影响呢？
    其次，上样前每次都要冲洗一下孔，有虫友说孔里是有高盐离子，丙烯酰胺凝聚时产生的，不冲洗的话也会有影响。
    我的PCR是没有经过纯化，纯化时由于试剂盒的回收率不同，会有一定程度的损失。
赞一下 回复此楼
7楼2011-05-06 00:19:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

在雨中

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
Originally posted by yujijiang at 2011-05-06 00:19:53:
我用的引物是amoA-1F-GC和amoA-2R。。。。用的是类似巢式PCR进行两轮扩增的。
另外，我配0%和100%的母液时都会过一下milipore的0.22um滤膜,因为母液在冰箱中放置一段时间后出现絮状的沉淀。。。。是否过膜也会 ...

你的0和100的母液怎么会有絮状沉淀呢？很不正常。
只有100的母液在4°冰箱放久了会有冰晶状的东西出现，因为低温溶解度降低，一般要在50-65°水浴彻底溶解后再使用。
赞一下 回复此楼
8楼2011-05-06 09:43:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ureyguo

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

母液问题吧，试剂里面去离子甲酰胺容易坏，祝好运
赞一下 回复此楼
9楼2011-05-06 17:31:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xiong-y-x

金虫 (正式写手)
楼主做DGGE的啊 我想问一下DGGE 能跑短的ssDNA吗 能否将不同长度的短的单链DNA分开呢
赞一下 回复此楼
10楼2012-09-25 16:09:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 yujijiang 的主题更新
131/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 考研调剂 +7 硕星赴 2026-04-09 7/350 2026-04-09 19:37 by 蒋皓禹
[考研] 289求调剂 +3 L1ttleTiger 2026-04-04 3/150 2026-04-09 19:07 by 探123
[考研] 267求调剂 +5 再忙也要吃饭啊 2026-04-09 5/250 2026-04-09 18:47 by stone_128
[考研] 284求调剂 +8 让我上岸吧阿西 2026-04-09 10/500 2026-04-09 18:34 by 段伟艳
[考研] 初试分332，一志愿报考西北工业大学， +8 故人?? 2026-04-09 8/400 2026-04-09 18:28 by l_paradox
[考研] 调剂 +12 JLLLLLLLLLL 2026-04-03 12/600 2026-04-09 16:14 by angeltong
[考研] 085501机械专硕 302分 不挑专业求调剂 +5 汪某. 2026-04-09 5/250 2026-04-09 15:38 by 蒋皓禹
[考研] 一志愿北京2，材料与化工308求调剂 +17 熊二想上岸 2026-04-04 18/900 2026-04-09 09:13 by leyan1127
[考研] 一志愿山东大学化学与化工学院材料与化工专硕，360分求调剂 +8 不愿透露姓名的� 2026-04-02 8/400 2026-04-08 20:12 by luoyongfeng
[考研] 一志愿211，化学学硕，310分，本科重点双非，求调剂 +20 努力奋斗112 2026-04-07 21/1050 2026-04-08 14:54 by screening
[考研] 305求调剂 +4 77Qi 2026-04-06 4/200 2026-04-07 20:06 by shanqishi
[考研] 考研调剂 +7 15615482637 2026-04-04 7/350 2026-04-06 22:56 by chenzhimin
[考研] 26自然地理学303分求调剂 +4 一战成硕啊啊啊� 2026-04-06 9/450 2026-04-06 20:35 by lin-da
[考研] 307求调剂 +3 所念及所望 2026-04-06 3/150 2026-04-06 17:30 by 土木硕士招生
[考研] 296求调剂 +3 汪！？！ 2026-04-05 4/200 2026-04-05 20:13 by 啵啵啵0119
[考研] 277求调剂 +5 考研调剂lxh 2026-04-05 5/250 2026-04-05 19:03 by chy09050039
[考研] 调剂 +3 李广火 2026-04-05 3/150 2026-04-05 18:57 by 蓝云思雨
[考研] 085500机械专硕初试288求调剂 +3 GZJguo666- 2026-04-05 3/150 2026-04-05 18:06 by jkddd
[考研] 调剂 +4 是可乐不是可乐 2026-04-04 4/200 2026-04-04 19:41 by 唐沐儿
[考研] 生物学硕341求调剂 +4 你笑起来像云朵 2026-04-03 4/200 2026-04-03 10:32 by macy2011
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭