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DGGE上样孔很亮，DNA跑不下来
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最近在做氨氧化细菌的生物多样性，我扩增了amoA的基因特异性很好，条带单一，但是做DGGE时好多跑不出孔，已经尝试了很多次，情况依旧。请各位大虾给小弟指点迷津。。。万分感谢！ DGGE的条件：6%的胶，变性梯度是30-60%，没有堆积胶，上样前PCR产物为纯化，上样前会将孔冲洗一下，电泳时间90V，13h。 我灌胶是做的0%和100%的母液，灌胶时高低浓度为14毫升，加入100微升APS和9微升的TEMED。  |
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【答案】应助回帖
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lstt09nk(金币+5): 热心 2011-05-05 18:22:27
lstt09nk(金币+5): 热心 2011-05-05 18:22:27
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文献中对细菌的amoA基因的DGGE操作条件，30-70%变化梯度用的比较多，也有40-60%的梯度。所以你实验中的操作条件应当合适的。 对了，你的引物是amoA-1F和amoA-2R吧？文献报道较多的那对？加上GC夹子扩增很难得呀，你这么容易就扩增出来了。。。。 如果我做的DGGE图如你所贴，我会把胶重新做一遍，尤其是0%和100%的胶重新配。还有，你的PCR产物如果效果很好的话，大可不必进行纯化也可进行DGGE，因为有的PCR产物纯化试剂盒纯化效果很差，会把PCR片段搞断裂，弥散，也许你纯化后可以走一次琼脂糖胶看看纯化后的效果。 |
6楼2011-05-05 14:32:39
【答案】应助回帖
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lstt09nk(金币+3): 感谢交流，欢迎常来 2011-05-05 18:22:07
lstt09nk(金币+3): 感谢交流，欢迎常来 2011-05-05 18:22:07
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我做过Archaea 的amoA基因的DGGE，效果很好。 细菌的amoA基因的DGGE没做过。呵呵。 Archaeal amoA genes were amplified using primers CrenamoA-23f and CrenamoA-616r without the requirement of a GC clamp. Archaeal amoA gene DGGE protocol: 0.75-mm-thick 8% (w/v) polyacrylamide gels, 15% to 60%,Gels were electrophoresed in 1 × TAE buffer at 60 °C for 14 h at 90 V. 楼主可以将你的引物序列，名称，PCR程序贴出来看看 |
2楼2011-05-05 12:26:30
3楼2011-05-05 13:00:00
4楼2011-05-05 13:34:01
