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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » DGGE上样孔很亮，DNA跑不下来
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yujijiang

铜虫 (初入文坛)

[求助] DGGE上样孔很亮，DNA跑不下来

最近在做氨氧化细菌的生物多样性，我扩增了amoA的基因特异性很好，条带单一，但是做DGGE时好多跑不出孔，已经尝试了很多次，情况依旧。请各位大虾给小弟指点迷津。。。万分感谢！
DGGE的条件：6%的胶，变性梯度是30-60%，没有堆积胶，上样前PCR产物为纯化，上样前会将孔冲洗一下，电泳时间90V，13h。
我灌胶是做的0%和100%的母液，灌胶时高低浓度为14毫升，加入100微升APS和9微升的TEMED。
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1楼 2011-05-05 11:40:07
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在雨中

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
lstt09nk(金币+3): 感谢交流，欢迎常来 2011-05-05 18:22:07
我做过Archaea 的amoA基因的DGGE，效果很好。
细菌的amoA基因的DGGE没做过。呵呵。
Archaeal amoA genes were amplified using primers CrenamoA-23f and CrenamoA-616r without the requirement of a GC clamp.
Archaeal amoA gene DGGE protocol: 0.75-mm-thick 8% (w/v) polyacrylamide gels, 15% to 60%,Gels were electrophoresed in 1 × TAE buffer at 60 °C for 14 h at 90 V.
楼主可以将你的引物序列，名称，PCR程序贴出来看看
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2楼2011-05-05 12:26:30
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冬虫夏草1

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

yujijiang(金币+1): 2011-05-05 13:31:18
你做的应该是SDS-PAGE电泳吧！
若是，请确定PAGE胶浓度与蛋白分子量关系，6%的胶不一定合适，做梯度吧，多尝试！
你说的“没有堆积胶”是指浓缩胶吧，一般都要的。
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倚楼听风雨，淡看江湖路！
3楼2011-05-05 13:00:00
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yujijiang

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by 在雨中 at 2011-05-05 12:26:30:
我做过Archaea 的amoA基因的DGGE，效果很好。
细菌的amoA基因的DGGE没做过。呵呵。
Archaeal amoA genes were amplified using primers CrenamoA-23f and CrenamoA-616r without the requirement of a GC clamp ...

首先感谢你的回帖，呵呵。。。我在
想是否是30%的梯度仍然太高了，以至于无法跑下来呢？
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4楼2011-05-05 13:34:01
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yujijiang

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by 冬虫夏草1 at 2011-05-05 13:00:00:
你做的应该是SDS-PAGE电泳吧！
若是，请确定PAGE胶浓度与蛋白分子量关系，6%的胶不一定合适，做梯度吧，多尝试！
你说的“没有堆积胶”是指浓缩胶吧，一般都要的。

我做的不是SDS-PAGE，是DGGE，是做微生物多态性的，跟蛋白质无关。。。还是感谢你的回帖。。。呵呵
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5楼2011-05-05 13:35:14
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在雨中

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
lstt09nk(金币+5): 热心 2011-05-05 18:22:27
引用回帖:
Originally posted by yujijiang at 2011-05-05 13:34:01:
首先感谢你的回帖，呵呵。。。我在
想是否是30%的梯度仍然太高了，以至于无法跑下来呢？

文献中对细菌的amoA基因的DGGE操作条件，30-70%变化梯度用的比较多，也有40-60%的梯度。所以你实验中的操作条件应当合适的。
对了，你的引物是amoA-1F和amoA-2R吧？文献报道较多的那对？加上GC夹子扩增很难得呀，你这么容易就扩增出来了。。。。

如果我做的DGGE图如你所贴，我会把胶重新做一遍，尤其是0%和100%的胶重新配。还有，你的PCR产物如果效果很好的话，大可不必进行纯化也可进行DGGE，因为有的PCR产物纯化试剂盒纯化效果很差，会把PCR片段搞断裂，弥散，也许你纯化后可以走一次琼脂糖胶看看纯化后的效果。
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6楼2011-05-05 14:32:39
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yujijiang

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by 在雨中 at 2011-05-05 14:32:39:
文献中对细菌的amoA基因的DGGE操作条件，30-70%变化梯度用的比较多，也有40-60%的梯度。所以你实验中的操作条件应当合适的。
对了，你的引物是amoA-1F和amoA-2R吧？文献报道较多的那对？加上GC夹子扩增很难得 ...

我用的引物是amoA-1F-GC和amoA-2R。。。。用的是类似巢式PCR进行两轮扩增的。
另外，我配0%和100%的母液时都会过一下milipore的0.22um滤膜,因为母液在冰箱中放置一段时间后出现絮状的沉淀。。。。是否过膜也会有影响呢？
    其次，上样前每次都要冲洗一下孔，有虫友说孔里是有高盐离子，丙烯酰胺凝聚时产生的，不冲洗的话也会有影响。
    我的PCR是没有经过纯化，纯化时由于试剂盒的回收率不同，会有一定程度的损失。
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7楼2011-05-06 00:19:53
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在雨中

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
Originally posted by yujijiang at 2011-05-06 00:19:53:
我用的引物是amoA-1F-GC和amoA-2R。。。。用的是类似巢式PCR进行两轮扩增的。
另外，我配0%和100%的母液时都会过一下milipore的0.22um滤膜,因为母液在冰箱中放置一段时间后出现絮状的沉淀。。。。是否过膜也会 ...

你的0和100的母液怎么会有絮状沉淀呢？很不正常。
只有100的母液在4°冰箱放久了会有冰晶状的东西出现，因为低温溶解度降低，一般要在50-65°水浴彻底溶解后再使用。
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8楼2011-05-06 09:43:04
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ureyguo

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

母液问题吧，试剂里面去离子甲酰胺容易坏，祝好运
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9楼2011-05-06 17:31:10
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xiong-y-x

金虫 (正式写手)
楼主做DGGE的啊 我想问一下DGGE 能跑短的ssDNA吗 能否将不同长度的短的单链DNA分开呢
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10楼2012-09-25 16:09:27
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