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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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aegeand

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): 多谢分享经验~再找找原因吧。祝实验顺利哦! 2011-05-08 19:54:43
顺便把我的烦恼和楼主一起分享吧。

我的目的片段在3.4 左右,LA扩增后,割胶回收目的片段,电泳检测回收结果,用最普通的taq加A尾(听说LA的加尾效率不是很高),用PCR产物纯化试剂盒纯化,在电泳检测产物,测浓度。

由于片段比较长,所以在连接之前将产物放到65度15分钟,希望他能够完全伸展,然后连接。问题就出在下面:我分别用fermentas T4连接酶,pEASY-T和pMD19连接系统,载体与插入片段的比例1:3,1:1都试过,平板上也能长出白斑,可是每题提完质粒,一鉴定,都是空载体,郁闷的要死,连接2个月都没有成功,已经到了崩溃的边缘。

你不是最背的。
11楼2011-05-08 18:28:39
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794378428

银虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by aegeand at 2011-05-08 18:28:39:
顺便把我的烦恼和楼主一起分享吧。

我的目的片段在3.4 左右,LA扩增后,割胶回收目的片段,电泳检测回收结果,用最普通的taq加A尾(听说LA的加尾效率不是很高),用PCR产物纯化试剂盒纯化,在电泳检测产物,测 ...

貌似分子实验很难做啊,呵呵,不知道问题出在哪里啊,我也很苦闷,继续努力吧,多看看理论方面的书,加强实验技能方面,呵呵,我老板这么要求的
12楼2011-05-08 21:48:05
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hwamg

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

载体和外源片段的比例摸索一下吧 我也用试剂盒  摸索了好几次终于成功啦  感觉那个说明书那是浮云 信不过
13楼2011-05-08 22:09:54
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shaohua2011

木虫 (正式写手)

LA是能够加A的。PCR循环结束后的72度延伸时间延长些。严格按照试剂盒操作,有试剂盒了就别再搞发明创造了。
探讨真正的科研。
14楼2011-05-21 16:02:28
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shaohua2011

木虫 (正式写手)

另外,是不是你的筛选平板有问题?Amp的抗性浓度是100ug/ml。感受态细胞是不是也有问题?我还没遇到T克隆不长的,一般T克隆能长一板子。
探讨真正的科研。
15楼2011-05-21 16:05:31
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coolkid527

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
757104楼: Originally posted by aegeand at 2011-05-08 18:28:39
顺便把我的烦恼和楼主一起分享吧。

我的目的片段在3.4 左右,LA扩增后,割胶回收目的片段,电泳检测回收结果,用最普通的taq加A尾(听说LA的加尾效率不是很高),用PCR产物纯化试剂盒纯化,在电泳检测产物,测浓 ...

2450...依旧连不上的飘过。。。
坚持!预防兽医学!
16楼2012-08-07 06:11:47
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)

TA克隆,
1,不能用保真酶;扩增后得带A
2,连接最好能过夜,这样阳性得率高
3,PCR产物需要回收纯化,浓度足够高
这样基本能出来
17楼2013-11-06 09:19:02
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bingdong05

银虫 (正式写手)

楼主,详细说下你的连接体系,连接时间,不然没办法帮你分析哈,一般pcr产物回收后跑个电泳看下浓度(估计),以添加相应量的载体,另外,连接时间最好适当延长些,3h可能短了点,试试延长下时间,或是过夜连接
18楼2013-11-06 09:42:30
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fuchange918

木虫 (正式写手)

引用回帖:
11楼: Originally posted by aegeand at 2011-05-08 18:28:39
顺便把我的烦恼和楼主一起分享吧。

我的目的片段在3.4 左右,LA扩增后,割胶回收目的片段,电泳检测回收结果,用最普通的taq加A尾(听说LA的加尾效率不是很高),用PCR产物纯化试剂盒纯化,在电泳检测产物,测浓 ...

请问您现在连上了吗?我也是一样的问题,愁死了
19楼2014-07-15 16:02:54
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fuchange918

木虫 (正式写手)

引用回帖:
16楼: Originally posted by coolkid527 at 2012-08-07 06:11:47
2450...依旧连不上的飘过。。。...

请问您现在连上了吗?我的片段和您的差不多大,也是连接不上,急死了
20楼2014-07-15 16:03:47
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