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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于PCR产物与pMD 19Tsimple连接的问题
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aegeand

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): 多谢分享经验~再找找原因吧。祝实验顺利哦！ 2011-05-08 19:54:43
顺便把我的烦恼和楼主一起分享吧。

我的目的片段在3.4 左右，LA扩增后，割胶回收目的片段，电泳检测回收结果，用最普通的taq加A尾（听说LA的加尾效率不是很高），用PCR产物纯化试剂盒纯化，在电泳检测产物，测浓度。

由于片段比较长，所以在连接之前将产物放到65度15分钟，希望他能够完全伸展，然后连接。问题就出在下面：我分别用fermentas T4连接酶，pEASY-T和pMD19连接系统，载体与插入片段的比例1：3，1：1都试过，平板上也能长出白斑，可是每题提完质粒，一鉴定，都是空载体，郁闷的要死，连接2个月都没有成功，已经到了崩溃的边缘。

你不是最背的。
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11楼2011-05-08 18:28:39
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794378428

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by aegeand at 2011-05-08 18:28:39:
顺便把我的烦恼和楼主一起分享吧。

我的目的片段在3.4 左右，LA扩增后，割胶回收目的片段，电泳检测回收结果，用最普通的taq加A尾（听说LA的加尾效率不是很高），用PCR产物纯化试剂盒纯化，在电泳检测产物，测 ...

貌似分子实验很难做啊，呵呵，不知道问题出在哪里啊，我也很苦闷，继续努力吧，多看看理论方面的书，加强实验技能方面，呵呵，我老板这么要求的
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12楼2011-05-08 21:48:05
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hwamg

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

载体和外源片段的比例摸索一下吧 我也用试剂盒  摸索了好几次终于成功啦  感觉那个说明书那是浮云 信不过
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13楼2011-05-08 22:09:54
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shaohua2011

木虫 (正式写手)
LA是能够加A的。PCR循环结束后的72度延伸时间延长些。严格按照试剂盒操作，有试剂盒了就别再搞发明创造了。
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探讨真正的科研。
14楼2011-05-21 16:02:28
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shaohua2011

木虫 (正式写手)
另外，是不是你的筛选平板有问题？Amp的抗性浓度是100ug/ml。感受态细胞是不是也有问题？我还没遇到T克隆不长的，一般T克隆能长一板子。
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探讨真正的科研。
15楼2011-05-21 16:05:31
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coolkid527

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
757104楼: Originally posted by aegeand at 2011-05-08 18:28:39
顺便把我的烦恼和楼主一起分享吧。

我的目的片段在3.4 左右，LA扩增后，割胶回收目的片段，电泳检测回收结果，用最普通的taq加A尾（听说LA的加尾效率不是很高），用PCR产物纯化试剂盒纯化，在电泳检测产物，测浓 ...

2450...依旧连不上的飘过。。。
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坚持！预防兽医学！
16楼2012-08-07 06:11:47
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)
TA克隆，
1，不能用保真酶；扩增后得带A
2，连接最好能过夜，这样阳性得率高
3，PCR产物需要回收纯化，浓度足够高
这样基本能出来
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17楼2013-11-06 09:19:02
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bingdong05

银虫 (正式写手)
楼主，详细说下你的连接体系，连接时间，不然没办法帮你分析哈，一般pcr产物回收后跑个电泳看下浓度（估计），以添加相应量的载体，另外，连接时间最好适当延长些，3h可能短了点，试试延长下时间，或是过夜连接
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18楼2013-11-06 09:42:30
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fuchange918

木虫 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by aegeand at 2011-05-08 18:28:39
顺便把我的烦恼和楼主一起分享吧。

我的目的片段在3.4 左右，LA扩增后，割胶回收目的片段，电泳检测回收结果，用最普通的taq加A尾（听说LA的加尾效率不是很高），用PCR产物纯化试剂盒纯化，在电泳检测产物，测浓 ...

请问您现在连上了吗？我也是一样的问题，愁死了
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19楼2014-07-15 16:02:54
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fuchange918

木虫 (正式写手)
引用回帖:
16楼: Originally posted by coolkid527 at 2012-08-07 06:11:47
2450...依旧连不上的飘过。。。...

请问您现在连上了吗？我的片段和您的差不多大，也是连接不上，急死了
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20楼2014-07-15 16:03:47
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