【答案】应助回帖

11楼2011-05-08 18:28:39

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银虫 (小有名气)

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Originally posted by aegeand at 2011-05-08 18:28:39:
顺便把我的烦恼和楼主一起分享吧。

我的目的片段在3.4 左右，LA扩增后，割胶回收目的片段，电泳检测回收结果，用最普通的taq加A尾（听说LA的加尾效率不是很高），用PCR产物纯化试剂盒纯化，在电泳检测产物，测 ...

貌似分子实验很难做啊，呵呵，不知道问题出在哪里啊，我也很苦闷，继续努力吧，多看看理论方面的书，加强实验技能方面，呵呵，我老板这么要求的

12楼2011-05-08 21:48:05

hwamg

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【答案】应助回帖

载体和外源片段的比例摸索一下吧我也用试剂盒摸索了好几次终于成功啦感觉那个说明书那是浮云信不过

13楼2011-05-08 22:09:54

shaohua2011

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LA是能够加A的。PCR循环结束后的72度延伸时间延长些。严格按照试剂盒操作，有试剂盒了就别再搞发明创造了。

探讨真正的科研。

14楼2011-05-21 16:02:28

shaohua2011

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另外，是不是你的筛选平板有问题？Amp的抗性浓度是100ug/ml。感受态细胞是不是也有问题？我还没遇到T克隆不长的，一般T克隆能长一板子。

探讨真正的科研。

15楼2011-05-21 16:05:31

coolkid527

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757104楼: Originally posted by aegeand at 2011-05-08 18:28:39
顺便把我的烦恼和楼主一起分享吧。

我的目的片段在3.4 左右，LA扩增后，割胶回收目的片段，电泳检测回收结果，用最普通的taq加A尾（听说LA的加尾效率不是很高），用PCR产物纯化试剂盒纯化，在电泳检测产物，测浓 ...

2450...依旧连不上的飘过。。。

坚持！预防兽医学！

16楼2012-08-07 06:11:47

charles08

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TA克隆，
1，不能用保真酶；扩增后得带A
2，连接最好能过夜，这样阳性得率高
3，PCR产物需要回收纯化，浓度足够高
这样基本能出来

17楼2013-11-06 09:19:02

bingdong05

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楼主，详细说下你的连接体系，连接时间，不然没办法帮你分析哈，一般pcr产物回收后跑个电泳看下浓度（估计），以添加相应量的载体，另外，连接时间最好适当延长些，3h可能短了点，试试延长下时间，或是过夜连接

18楼2013-11-06 09:42:30

fuchange918

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11楼: Originally posted by aegeand at 2011-05-08 18:28:39
顺便把我的烦恼和楼主一起分享吧。

我的目的片段在3.4 左右，LA扩增后，割胶回收目的片段，电泳检测回收结果，用最普通的taq加A尾（听说LA的加尾效率不是很高），用PCR产物纯化试剂盒纯化，在电泳检测产物，测浓 ...

请问您现在连上了吗？我也是一样的问题，愁死了

19楼2014-07-15 16:02:54

fuchange918

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16楼: Originally posted by coolkid527 at 2012-08-07 06:11:47
2450...依旧连不上的飘过。。。...

请问您现在连上了吗？我的片段和您的差不多大，也是连接不上，急死了

20楼2014-07-15 16:03:47