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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于PCR产物与pMD 19Tsimple连接的问题
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794378428

银虫 (小有名气)

[求助] 关于PCR产物与pMD 19Tsimple连接的问题

我的PCR纯化产物为什么pMD 19Tsimple连接不上啊，求指导
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1楼 2011-05-04 08:32:32
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aegeand

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): 多谢分享经验~再找找原因吧。祝实验顺利哦！ 2011-05-08 19:54:43
顺便把我的烦恼和楼主一起分享吧。

我的目的片段在3.4 左右，LA扩增后，割胶回收目的片段，电泳检测回收结果，用最普通的taq加A尾（听说LA的加尾效率不是很高），用PCR产物纯化试剂盒纯化，在电泳检测产物，测浓度。

由于片段比较长，所以在连接之前将产物放到65度15分钟，希望他能够完全伸展，然后连接。问题就出在下面：我分别用fermentas T4连接酶，pEASY-T和pMD19连接系统，载体与插入片段的比例1：3，1：1都试过，平板上也能长出白斑，可是每题提完质粒，一鉴定，都是空载体，郁闷的要死，连接2个月都没有成功，已经到了崩溃的边缘。

你不是最背的。
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11楼2011-05-08 18:28:39
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★ ★
dhd997(金币+3): 一条一金币，呵呵 2011-05-04 11:05:32
794378428(金币+1): 2011-05-04 21:03:10
794378428(金币+1): 2011-05-04 21:03:33
1：连接体系的问题，连接时间呢？
2：质粒和你的目的基因酶切是否完全?
3:感受态细胞又如何？
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
2楼2011-05-04 08:52:31
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zlu520

至尊木虫 (职业作家)

限制人

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): 有道理 2011-05-04 11:05:48
酶如果正确的话，条件一定要合适啊，时间等。。
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无完人！
3楼2011-05-04 10:20:07
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liulinlin123

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): 对啊 2011-05-04 11:05:57
可以考虑一下 链接时增加热击  65度5min
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4楼2011-05-04 10:30:56
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