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huangqihong

铁虫 (小有名气)

[求助] 关于PFGE的问题

请教各位大虾,如附件,我跑了2次原核生物全基因组的PFGE,这菌株在基因组外还有游离的质粒。第一次似乎DNA都没有跑出胶块(后面4个泳道是经过SalI酶切的基因组),当时怀疑用的细胞太多,第二次用的细胞量减少了,但是为什么还是没有跑出东西?求解


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gaoyang636

木虫 (著名写手)

胶浓度? 电压?电泳时间? 啥的 详细说说先~
2楼2011-04-29 18:27:00
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huangqihong

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by gaoyang636 at 2011-04-29 18:27:00:
胶浓度? 电压?电泳时间? 啥的 详细说说先~

电泳条件:5-50s, 6V/cm, 20h, 14°。胶浓度:1%。
这些都是参照文献里面的条件,他们做的菌和我做的同一个属,应该差别不大。但就是不知道怎么回事
3楼2011-04-29 22:24:12
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王营wy

新虫 (初入文坛)

你好,楼主,我跑的乳杆菌的PFGE,用酶XbaI处理,电泳后跟你的图相似,点样孔很亮,泳道没有条带,不知道你的问题是怎么解决的?期盼回复~~
阳光总在风雨后
4楼2011-11-03 13:13:11
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huangqihong

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 王营wy at 2011-11-03 13:13:11:
你好,楼主,我跑的乳杆菌的PFGE,用酶XbaI处理,电泳后跟你的图相似,点样孔很亮,泳道没有条带,不知道你的问题是怎么解决的?期盼回复~~

把plug在酶切之前用酶切缓冲液洗三次,然后再酶切,可能直接酶切体系不合适。但是仍然有很多存在于点样孔。
5楼2011-11-04 02:54:44
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王营wy

新虫 (初入文坛)

送鲜花一朵
谢谢,我做的时候用酶切缓冲液只洗了一次,下次我多洗两次。您做PFGE时对于条件优化这方面有什么经验,可以分享一下吗?
阳光总在风雨后
6楼2012-01-04 09:26:54
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带刀猎人

新虫 (小有名气)

请检查菌体是否裂解,就是在CLB里的Proteinase K是否将菌体裂解了
7楼2012-04-13 14:42:07
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刘仁坤2013

新虫 (小有名气)

最后解决了吗
8楼2013-12-30 20:20:15
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huangqihong

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by 刘仁坤2013 at 2013-12-30 20:20:15
最后解决了吗

算是部分解决吧,样品部分跑进胶里面,但是还有很多在plug里。
9楼2013-12-31 08:29:28
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201130212017

银虫 (小有名气)

真的是酶切的问题么?
我跑的PFGE也是只有点样孔亮,无条带
点样孔亮的也只是marker未做酶切啊
每天都高兴,幸福
10楼2014-05-07 13:37:24
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