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小小_木虫

木虫 (小有名气)

[求助] 急!互补不回去,应该怎么办?

枯草芽孢杆菌,利用基因同源重组的方法将基因组中的A基因缺失掉,缺失后的性状比较明显,抑菌活性明显下降。但是做互补时,却始终都互补不回去:我用的是pHY300PLK质粒做载体,连入完整的A基因片段后,电击转入枯草芽孢杆菌菌株中,然后就测定是否互补回去。不知道我的方法是否有误?恳请高手指点……
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★ ★
dhd997(金币+3, EPI+1): good 2011-04-27 13:13:31
首先你要确定你的基因连接没有什么问题,一定要验证正确。
基因连入重组载体后,基因启动子的方向是不是和载体上强启动子方向一致呢?还有你的基因有没有启动子?
如果不行,就换载体。
可以用诱导剂试试,但是一般过量表达载体上的强启动子是不需要诱导剂诱导的,可是有时并不一定的。。。
还有过量表达载体的表达也需要一定的时间,可以把时间延长一下。
Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
2楼2011-04-27 12:31:43
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小小_木虫

木虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-04-27 12:31:43:
首先你要确定你的基因连接没有什么问题,一定要验证正确。
基因连入重组载体后,基因启动子的方向是不是和载体上强启动子方向一致呢?还有你的基因有没有启动子?
如果不行,就换载体。
可以用诱导剂试试,但是 ...

非常感谢!,祝工作顺利!
3楼2011-04-27 14:26:56
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地主的小长工

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): good! 2011-04-28 15:09:06
小小_木虫(金币+1): 你好,请问:如果确认没有问题,那可能是什么呢?谢谢! 2011-04-28 15:46:28
1.首先确认一下这个基因外源表达后,是不是真的表达了,可以用RT检测基因是否转录,或者用WB检测蛋白是否表达。如果确认没有问题,那可能是:
2.抑菌活性明显下降,可能不是基因本身确实引起的,而是在缺失的过程中,影响的周围的基因的表达所引起的。
天天开心
4楼2011-04-28 13:55:43
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地主的小长工

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, EPI+1): 理论知识和实际经验都很强,有前途~ 2011-04-29 23:49:21
你先看看这个基因你缺失的部分,是否和别的基因的编码区,转录起始区,转录终止区有重叠,如果有,就很有可能影响了周围基因的表达;还有和别的基因如果在同一个操纵子内,它的缺失也会影响周围基因的表达,还有个问题,会不会你的基因缺失或者过表达之后的表型是一样的,我实验室有个同学就做了这样一个基因,它缺失和大量表达的变型是一致的,而少量表达之后可以回复这个表型。
天天开心
5楼2011-04-29 22:33:19
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yiner

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 地主的小长工 at 2011-04-29 22:33:19
你先看看这个基因你缺失的部分,是否和别的基因的编码区,转录起始区,转录终止区有重叠,如果有,就很有可能影响了周围基因的表达;还有和别的基因如果在同一个操纵子内,它的缺失也会影响周围基因的表达,还有个问 ...

请问少量表达怎么做啊
fighting!!!!
6楼2017-04-27 10:26:27
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