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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 急！互补不回去，应该怎么办？
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小小_木虫

木虫 (小有名气)

[求助] 急！互补不回去，应该怎么办？

枯草芽孢杆菌，利用基因同源重组的方法将基因组中的A基因缺失掉，缺失后的性状比较明显，抑菌活性明显下降。但是做互补时，却始终都互补不回去：我用的是pHY300PLK质粒做载体，连入完整的A基因片段后，电击转入枯草芽孢杆菌菌株中，然后就测定是否互补回去。不知道我的方法是否有误？恳请高手指点……
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1楼 2011-04-27 10:02:02
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小小_木虫

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-04-27 12:31:43:
首先你要确定你的基因连接没有什么问题，一定要验证正确。
基因连入重组载体后，基因启动子的方向是不是和载体上强启动子方向一致呢？还有你的基因有没有启动子？
如果不行，就换载体。
可以用诱导剂试试，但是 ...

非常感谢！，祝工作顺利！
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3楼2011-04-27 14:26:56
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★ ★
dhd997(金币+3, EPI+1): good 2011-04-27 13:13:31
首先你要确定你的基因连接没有什么问题，一定要验证正确。
基因连入重组载体后，基因启动子的方向是不是和载体上强启动子方向一致呢？还有你的基因有没有启动子？
如果不行，就换载体。
可以用诱导剂试试，但是一般过量表达载体上的强启动子是不需要诱导剂诱导的，可是有时并不一定的。。。
还有过量表达载体的表达也需要一定的时间，可以把时间延长一下。
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
2楼2011-04-27 12:31:43
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地主的小长工

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): good! 2011-04-28 15:09:06
小小_木虫(金币+1): 你好，请问：如果确认没有问题，那可能是什么呢？谢谢！ 2011-04-28 15:46:28
1.首先确认一下这个基因外源表达后，是不是真的表达了，可以用RT检测基因是否转录，或者用WB检测蛋白是否表达。如果确认没有问题，那可能是：
2.抑菌活性明显下降，可能不是基因本身确实引起的，而是在缺失的过程中，影响的周围的基因的表达所引起的。
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天天开心
4楼2011-04-28 13:55:43
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地主的小长工

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, EPI+1): 理论知识和实际经验都很强，有前途~ 2011-04-29 23:49:21
你先看看这个基因你缺失的部分，是否和别的基因的编码区，转录起始区，转录终止区有重叠，如果有，就很有可能影响了周围基因的表达；还有和别的基因如果在同一个操纵子内，它的缺失也会影响周围基因的表达，还有个问题，会不会你的基因缺失或者过表达之后的表型是一样的，我实验室有个同学就做了这样一个基因，它缺失和大量表达的变型是一致的，而少量表达之后可以回复这个表型。
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天天开心
5楼2011-04-29 22:33:19
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