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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 【求助】银染法的具体步骤
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p2011

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助】银染法的具体步骤 已有10人参与

求核酸PCR银染法的具体步骤..越详细越好，谢谢！！
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1楼 2011-04-12 10:00:30
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jhu132llh

荣誉版主 (知名作家)

大洪
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+2): 鼓励发帖交流。 2011-04-12 21:43:51
银染法还是比较麻烦的
你要是有《分子克隆实验指南》的话可以看那书的
那书上的方法
就很好用
我们常用的，一点问题也没有
很敏感，分辨率也很高
你是没书的话
估计得我有空才能给您讲讲了
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青春的岁月，我们身不由己，只因这胸中燃烧的梦想！
2楼2011-04-12 11:59:36
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p2011

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by jhu132llh at 2011-04-12 11:59:36:
银染法还是比较麻烦的
你要是有《分子克隆实验指南》的话可以看那书的
那书上的方法
就很好用
我们常用的，一点问题也没有
很敏感，分辨率也很高
你是没书的话
估计得我有空才能给您讲讲了

真本书我有，但是我还想问一下你们染色是完全按照这本书上来的还是有一些条件优化？你们染色一次大概要多久？我原来用EB染色，但是胶的整体清晰度很差想要换银染试试，但是具体的实验条件不知道用不用摸索..
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3楼2011-04-12 15:00:22
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jhu132llh

荣誉版主 (知名作家)

大洪
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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+2): 感谢参与 2011-04-13 19:41:01
引用回帖:
Originally posted by p2011 at 2011-04-12 15:00:22:
真本书我有，但是我还想问一下你们染色是完全按照这本书上来的还是有一些条件优化？你们染色一次大概要多久？我原来用EB染色，但是胶的整体清晰度很差想要换银染试试，但是具体的实验条件不知道用不用摸索..

基本没有优化
就是按照它的步骤往下做
配液什么的配准了
显色的时候盯住了
仪但效果出来了就马上终止
跑的SNP都还很好的
没问题
一般染一次得一个下午的时间吧
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青春的岁月，我们身不由己，只因这胸中燃烧的梦想！
4楼2011-04-12 15:46:21
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p2011

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by jhu132llh at 2011-04-12 15:46:21:
基本没有优化
就是按照它的步骤往下做
配液什么的配准了
显色的时候盯住了
仪但效果出来了就马上终止
跑的SNP都还很好的
没问题
一般染一次得一个下午的时间吧

哦，知道了，谢谢！！
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5楼2011-04-12 16:16:38
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reasonspare

木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★
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lstt09nk(金币+5): 欢迎回归^_^ 2011-04-13 19:41:39
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Originally posted by p2011 at 2011-04-12 16:16:38:
哦，知道了，谢谢！！

Silver staining protocol
Compatible with mass spectrometry, excellent signal-to-noise ratio
(Ref: Protana website http://www.protana.com/services/protocols/default.asp)
Buffers
Fixer: 50% MeOH, 12% HAc, 0.05% formalin (35% Formaldehyde) 200 ml
100 ml MeOH (99.8%)
24 ml HAc (100%)
100 μl formalin (35% Formaldehyd)
76 ml H2O (Milli-Q)
Wash: 35% EtOH (96%) 200 ml
73 ml EtOH
127 ml H2O
Sensitizing: 0.02% Na2S2O3 200 ml
0.04 g Na2S2O3
200 ml H2O
Silver nitrate:0.2% AgNO3, 0.076% formalin (35% Formaldehyde) 200 ml
0.4 g AgNO3
152 μl formalin (35% Formaldehyde)
200 ml H2O
Developer: 6% Na2CO3, 0.05% formalin (35% Formaldehyde),
0.0004% Na2S2O3 400 ml
24 g Na2CO3
200 μl formalin (35% Formaldehyde)
8 ml 0.02% Na2S2O3
392 ml H2O
Stop solution:50% MeOH, 12% HAc 200 ml
100 ml MeOH
24 ml HAc
76 ml H2O
Procedure
1. Fix gel: 50% MeOH, 12% Hac, 0.05% formalin, 2 hrs or overnight
2. Wash gel: 35% EtOH for 20 mins.
3. Wash gel: 35% EtOH for 20 mins.
4. Wash gel: 35% EtOH for 20 mins.
5. Sensitize gel: 0.02% Na2S2O3 for 2 mins.
6. Wash gel: H2O for 5 mins.
7. Wash gel: H2O for 5 mins.
8. Wash gel: H2O for 5 mins.
9. Stain gel: 0.2% AgNO3, 0.076% formalin for 20 mins.
10. Wash gel: H2O for 1 min.
11. Wash gel: H2O for 1 min.
12. Develop gel: 6% Na2CO3, 0.05% formalin, 0.0004% Na2S2O3
13. Stop staining: 50% MeOH, 12% HAc for 5 mins.
14. Leave the gel at 4ºC in: 1% Hac
Remark: For coomassie blue stained gel, wash O/N in water, then start from step 5.
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大慈大悲观世音救苦救难观世音有求必应观世音普渡众生观世音千手千眼观世音官大敢管观世音无处不在观世音普观普长观世音南无观世音菩萨
6楼2011-04-13 10:59:21
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reasonspare

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★
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Originally posted by p2011 at 2011-04-12 10:00:30:
求核酸PCR银染法的具体步骤..越详细越好，谢谢！！

可是我的是核酸步骤同蛋白的银染步骤相同吗？？谢谢..


步骤不是完全一致的，
具体如下


   1. Separate plates while keeping the gel attached to short glass.

      
   2. Fix the gel: Place gel in tray, cover with cold fix/stop solution and agitate well for 20 minutes. Gel may be stored in fix/stop solution overnight. Save fix/stop solution and place back in freezer.

      
   3. Wash the gel: Rinse the gel 3 times for 2-3 min. each in ddH2O using agitation. Lift gel from solution and allow to drain 10-20 seconds.

      
   4. Stain the gel: Transfer the gel to staining solution and agitate well for 30 minutes.

      
   5. Pour 1L of the developing solution into a tray. Transfer staining solution to beaker. Rinse tray and fill with ddH2O.

      
   6. Rinse gel for 5-10 seconds ONLY. Transfer to developing solution.

      
   7. Agitate in developing solution until bands begin to appear. Transfer gel to remaining chilled developing solution for 2-3 minutes.

      
   8. Fix the gel: add 1L of Fix/stop solution directly to developing solution and agitate for 2-3 minutes

      
   9. Rinse gel twice for two minutes each in ddH2O.

      
  10. Dry gel on glass



Fix/stop solution Staining solution

200ml of glacial acidic acid 2g (1 packet) of silver nitrate (AgNO3)

1,800ml ultrapure water 3ml (1 vial) of 37% Formaldehyde

Freeze for approx. 3 hours 2L ultrapure water



Developing solution

60g (1 packet) Sodium Carbonate (Na2CO3)

2L ultrapure water

**chill to 10oC. I place sol. In freezer for approx 4 hours and stir to break up ice prior to use.

Immediately before use add

3ml (1 vial) of 37% Formaldehyde

400m l aliquot Sodium Thiosulfate (discard remaining)
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大慈大悲观世音救苦救难观世音有求必应观世音普渡众生观世音千手千眼观世音官大敢管观世音无处不在观世音普观普长观世音南无观世音菩萨
7楼2011-04-16 10:50:17
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卧龙ac
8楼2012-08-02 20:01:52
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木虫 (正式写手)
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送鲜花一朵
silicare: 金币-5, 应助指数-2, 屏蔽内容 2012-08-31 18:30:36
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9楼2012-08-06 13:11:10
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淡蓝色的天空

新虫 (初入文坛)
★
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2楼: Originally posted by jhu132llh at 2011-04-12 11:59:36
银染法还是比较麻烦的
你要是有《分子克隆实验指南》的话可以看那书的
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估计得我有空才能给您讲讲了

我的书是中文版的，可是貌似没有看到银染这一说啊
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10楼2013-12-01 17:56:16
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