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虫儿7893

银虫 (小有名气)

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虫号: 651766
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[求助] 第一次做AFLP，各种茫然求指点

以前没有经验，哪步出错了也不晓得，请做过的帮忙指点：
1.酶切后电泳图片（图1）：条带大小正常吗？10000的marker

2.选择性扩增条带很弥散（图2），用1%琼脂糖胶跑电泳紫外透射观察的。这样做有什么问题？很多文献都是用银染法观察，必须这样做吗？

图1. 从左到右：酶切片段1，酶切片段2，目的基因组，10000marker

图2 从左到右：选择性扩增条带，10000marker

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核酸与基因生物学

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1楼 2012-08-02 16:16:21

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pyz1979

铜虫 (初入文坛)

MolEPI: 1
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专业: 系统生物学

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小丹木木: 金币+5, MolEPI+1, 鼓励积极热心应助 2012-08-07 15:42:23
虫儿7893: 金币+10, ★★★很有帮助, 非常感谢！ 2012-08-07 17:03:35

AFLP一般分为酶切、连接、预扩、选扩4个步骤，而且对于基因组DNA的纯度要求比较高，建议你测一下260/280比值，看看纯度如何，之后再进行实验。

至于选扩产物弥散，一个原因跟基因组DNA纯度有关，如果纯度没有问题的话，那可能跟你的引物有关，引物的选择性碱基根据文献确认，一般为G或T比较好一点，自己也可以都做一下看看结果，如果都是弥散，就可以试着再加一个碱基做一下，根据AFLP原理，选择性碱基越多，条带越少。

建议你带一个确定的基因组DNA，比如你做大肠的，就找一个大肠纯菌株DNA一起做，这样如果它能做出来，而你的样品做不出来，那实验条件没有问题，而你的样品就有问题。

至于银染法和琼脂糖电泳，由于我只做过后面一个，只能凭经验来说：能用琼脂糖分开的其实用琼脂糖就可以了。