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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】质粒测序测不到克隆位点
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junjie2010

铜虫 (小有名气)
PCR鉴定不可靠的，一般情况下配合酶切验证，两者都通过后再送去测序，楼主说的情况很有可能是载体自连造成的。有时候PCR和酶切验证都不能验证结果是正确的，我就碰到这样的情况。没有什么重新做就是了，有时候重复是最好的答案！
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11楼2011-03-21 19:32:03
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wzwhq

铁虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by -超越beyond at 2011-03-21 14:50:58:
请问为什么说PCR不太可靠啊？我也在做相关的工作

因为PCR会有假阳性的情况出现啊。
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12楼2011-03-22 09:28:23
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鸟瞰世界

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by junjie2010 at 2011-03-21 19:32:03:
PCR鉴定不可靠的，一般情况下配合酶切验证，两者都通过后再送去测序，楼主说的情况很有可能是载体自连造成的。有时候PCR和酶切验证都不能验证结果是正确的，我就碰到这样的情况。没有什么重新做就是了，有时候重复 ...

序列比对可能确实是载体自连了，谢谢！
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13楼2011-03-23 08:58:20
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amilie030312

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+2): 鼓励交流 2011-04-02 08:11:55
引用回帖:
Originally posted by 鸟瞰世界 at 2011-03-21 13:11:09:
载体自连接头序列也不会丢失吧？

如果酶里面有核酸外切酶的污染那么片段末端就会损失掉几个碱基，然后再自连上之后测序就会发现载体序列有，但没目的序列而且还没有接头。
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14楼2011-03-31 13:49:22
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鸟瞰世界

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by amilie030312 at 2011-03-31 13:49:22:
如果酶里面有核酸外切酶的污染那么片段末端就会损失掉几个碱基，然后再自连上之后测序就会发现载体序列有，但没目的序列而且还没有接头。

多谢指教！
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15楼2011-04-02 08:10:14
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mnswangjian

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
PCR筛选是最基本的方法。我用载体（pUC19）上的测序引物M13R分别与克隆上下游引物做双PCR筛选。只要克隆上去就有带。根据长度位置可可确定插入拷贝数、方向。还能排除假阳性。挺好的。建议试一下。mnswangjian
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16楼2013-01-23 22:06:43
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琼Echo

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我想说你们出现过PCR检测有目的片段、酶切同样能切开，但测序时却显示检测不到信号呢？
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恋着拟南芥的菇凉
17楼2013-07-16 11:17:16
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