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ksnight

金虫 (正式写手)


[交流] 【求助/交流】用过葡聚糖凝胶的请进!!!

1.        目的:目标分子Mw=5300  杂质分子2000,及3300。分离总量约150mg 其中目标分子量约50mg。 杂质和目标分子均水溶。(上的量是否太多?)
2.        方法:采用Sephadex-G25 (普通)1000-5000。床体积4-6ml/g 折中算5,用的柱子是内径2cm,长度35cm,柱床体积110ml。计划用干凝胶约25g,(干凝胶量是否合适?装柱长度是否合适?)一般情况下,柱床体积和外水体积的比例是多少?用此种类型的凝胶,目标分子不保留,直接流出,杂质分子在里面保留一定时间,达到分离目的。

凝胶预处理和装柱子:1,用蒸馏水溶胀8h,倾倒除去一些小的漂浮的凝胶。2,再倒入沸水中约0.5h,除去气泡。冷却后填柱子(自然沉降)。(除去气泡煮沸的时间是否足够,长时间煮沸是否会破坏凝胶的结构?)(是否需要用盐水来进行自然沉降?)(需要用盐水来溶胀吗?)(有必要用指示剂来确定柱子是否可用吗?)

上样:用2-5ml盐水溶解后加入,然后用盐水洗脱剂洗脱。待到收集到外水体积Vo后,开始把收集的水溶液用二氯甲烷萃取,干燥,浓缩,点板(TLC),换瓶收集,核磁分别确定是否分纯。

没有恒流泵怎么控制流速呢?

这是我的全过程,帮忙解决下以上问题,过程有什么地方有不妥的地方请指出,谢谢!!!

[ Last edited by ksnight on 2011-2-28 at 20:16 ]
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ksnight

金虫 (正式写手)


引用回帖:
Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-02-28 19:52:57:
上样量的体积要注意,太大不行的,如果要找标准,那就找一下说明书。我记得似乎是推荐柱床体积的1%还是多少的。而且你的杂质跟目的物质分子量差别不大,感觉可能分开得不干净,试着做一下吧。

推荐的确实是1%,我的大约柱床体积为110ml,也就是加1ml左右。

有说加样大约是每ml床体积加0.2mg,这样算下来只能加20mg,汗,100mg超太多了。

还有个基本的问题没有明白,柱床体积就等于柱子的体积吧?
5楼2011-02-28 20:21:17
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rainwander(金币+1): 鼓励积极参与交流~~~ 2011-02-28 19:18:07
ksnight(金币+2): 2011-02-28 19:18:43
ksnight(金币+3): 2011-04-26 10:07:09
装好柱之后用蓝色葡聚糖来过,看柱效。上样量我感觉大了些,分子量差别不大的物质,柱效稍微差一点就肯定分不开的。
2楼2011-02-28 18:35:37
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ksnight

金虫 (正式写手)


引用回帖:
Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-02-28 18:35:37:
装好柱之后用蓝色葡聚糖来过,看柱效。上样量我感觉大了些,分子量差别不大的物质,柱效稍微差一点就肯定分不开的。

我用的是G25  1000到5000  我的目标分子是5300,
感觉可以直接出来。

量我也感觉多了点,可能上个100mg差不多。

不知道标准的是怎样
3楼2011-02-28 19:20:45
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ksnight(金币+2): 3q 2011-02-28 20:19:35
ksnight(金币+2): 2011-04-26 10:07:25
上样量的体积要注意,太大不行的,如果要找标准,那就找一下说明书。我记得似乎是推荐柱床体积的1%还是多少的。而且你的杂质跟目的物质分子量差别不大,感觉可能分开得不干净,试着做一下吧。
4楼2011-02-28 19:52:57
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