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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】用过葡聚糖凝胶的请进！！！
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ksnight

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】用过葡聚糖凝胶的请进！！！

1.        目的：目标分子Mw=5300  杂质分子2000，及3300。分离总量约150mg 其中目标分子量约50mg。 杂质和目标分子均水溶。（上的量是否太多？）
2.        方法：采用Sephadex-G25 （普通）1000-5000。床体积4-6ml/g 折中算5，用的柱子是内径2cm，长度35cm，柱床体积110ml。计划用干凝胶约25g，（干凝胶量是否合适？装柱长度是否合适？)一般情况下，柱床体积和外水体积的比例是多少？用此种类型的凝胶，目标分子不保留，直接流出，杂质分子在里面保留一定时间，达到分离目的。

凝胶预处理和装柱子：1，用蒸馏水溶胀8h，倾倒除去一些小的漂浮的凝胶。2，再倒入沸水中约0.5h，除去气泡。冷却后填柱子（自然沉降）。（除去气泡煮沸的时间是否足够，长时间煮沸是否会破坏凝胶的结构？）（是否需要用盐水来进行自然沉降？）（需要用盐水来溶胀吗？）（有必要用指示剂来确定柱子是否可用吗？）

上样：用2-5ml盐水溶解后加入，然后用盐水洗脱剂洗脱。待到收集到外水体积Vo后，开始把收集的水溶液用二氯甲烷萃取，干燥，浓缩，点板（TLC），换瓶收集，核磁分别确定是否分纯。

没有恒流泵怎么控制流速呢？

这是我的全过程，帮忙解决下以上问题，过程有什么地方有不妥的地方请指出，谢谢！！！

[ Last edited by ksnight on 2011-2-28 at 20:16 ]
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1楼 2011-02-28 17:36:35
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)
ksnight(金币+2): 3q 2011-02-28 20:19:35
ksnight(金币+2): 2011-04-26 10:07:25
上样量的体积要注意，太大不行的，如果要找标准，那就找一下说明书。我记得似乎是推荐柱床体积的1%还是多少的。而且你的杂质跟目的物质分子量差别不大，感觉可能分开得不干净，试着做一下吧。
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4楼2011-02-28 19:52:57
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)
★
rainwander(金币+1): 鼓励积极参与交流~~~ 2011-02-28 19:18:07
ksnight(金币+2): 2011-02-28 19:18:43
ksnight(金币+3): 2011-04-26 10:07:09
装好柱之后用蓝色葡聚糖来过，看柱效。上样量我感觉大了些，分子量差别不大的物质，柱效稍微差一点就肯定分不开的。
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2楼2011-02-28 18:35:37
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ksnight

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-02-28 18:35:37:
装好柱之后用蓝色葡聚糖来过，看柱效。上样量我感觉大了些，分子量差别不大的物质，柱效稍微差一点就肯定分不开的。

我用的是G25  1000到5000  我的目标分子是5300，
感觉可以直接出来。

量我也感觉多了点，可能上个100mg差不多。

不知道标准的是怎样
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3楼2011-02-28 19:20:45
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ksnight

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-02-28 19:52:57:
上样量的体积要注意，太大不行的，如果要找标准，那就找一下说明书。我记得似乎是推荐柱床体积的1%还是多少的。而且你的杂质跟目的物质分子量差别不大，感觉可能分开得不干净，试着做一下吧。

推荐的确实是1%，我的大约柱床体积为110ml，也就是加1ml左右。

有说加样大约是每ml床体积加0.2mg，这样算下来只能加20mg，汗，100mg超太多了。

还有个基本的问题没有明白，柱床体积就等于柱子的体积吧？
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5楼2011-02-28 20:21:17
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