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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】两重PCR
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xwsooo

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】两重PCR

我用的是50微升PCR体系，一个反应体系里有两对引物（共三条引物，一条是公共引物--下游引物），两条目的产物相差18bp，用4%琼脂糖胶跑了60min,不知道为什么，有时候能分出较小的那个条带，有时候分不出来，感觉好像该条带的上游引物被另外一条上游引物竞争性抑制了？
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1楼 2011-02-28 13:33:02
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
xwsooo(金币+1): 2011-02-28 22:18:29
为什么不尝试着分成两次PCR做呢，呵呵。你这个相当于半巢式了。
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2楼2011-02-28 13:39:50
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jiangxue82

木虫 (著名写手)
xwsooo(金币+1): 2011-03-01 20:29:53
不懂 帮顶下
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3楼2011-02-28 13:41:54
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love_st

金虫 (著名写手)
xwsooo(金币+1): 2011-02-28 22:19:55
引用回帖:
Originally posted by xwsooo at 2011-02-28 13:33:02:
我用的是50微升PCR体系，一个反应体系里有两对引物（共三条引物，一条是公共引物--下游引物），两条目的产物相差18bp，用4%琼脂糖胶跑了60min,不知道为什么，有时候能分出较小的那个条带，有时候分不出来，感觉好 ...

那你分别单独PCR然后一起跑电泳看下，做个对比嘛
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4楼2011-02-28 13:48:19
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leiyunting

木虫 (著名写手)
恩，做个对照好
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5楼2011-02-28 13:49:43
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xwsooo

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2011-02-28 13:39:50:
为什么不尝试着分成两次PCR做呢，呵呵。你这个相当于半巢式了。

分两次已经做过了，问题不大，我想一次解决最好了～～～～有没有什么好建议呢？？
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6楼2011-02-28 22:19:34
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xwsooo

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by love_st at 2011-02-28 13:48:19:
那你分别单独PCR然后一起跑电泳看下，做个对比嘛

单独PCR跑过了，问题不大～～～
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7楼2011-02-28 22:21:04
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
xwsooo(金币+1): 2011-03-01 20:29:31
引用回帖:
Originally posted by xwsooo at 2011-02-28 22:19:34:
分两次已经做过了，问题不大，我想一次解决最好了～～～～有没有什么好建议呢？？

可以尝试优化一下退火温度，呵呵
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8楼2011-02-28 23:43:39
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xwsooo

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2011-02-28 23:43:39:
可以尝试优化一下退火温度，呵呵

你是说两对引物在一起跑的退火温度可能和单对引物跑时不同???我现在的退火温度已经到65度了~~~
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9楼2011-03-01 20:27:55
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
★
rainwander(金币+1): 鼓励参与交流~~~ 2011-03-01 22:41:48
引用回帖:
Originally posted by xwsooo at 2011-03-01 20:27:55:
你是说两对引物在一起跑的退火温度可能和单对引物跑时不同???我现在的退火温度已经到65度了~~~

呵呵，两对引物一起的时候，理论上会由于它们的退火温度不同而有一个最佳的退火温度使得你的产物最亮。
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10楼2011-03-01 20:55:02
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xwsooo

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2011-03-01 20:55:02:
呵呵，两对引物一起的时候，理论上会由于它们的退火温度不同而有一个最佳的退火温度使得你的产物最亮。

哦,酱紫阿,我现在在调两条上游引物的浓度(正交设计,梯度~~),恩,那我也试一试退火温度梯度,(想想看现在的退火温度貌似比较合适条带较量的引物)
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11楼2011-03-01 21:38:55
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