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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】请大家帮忙分析一下PCR结果，谢谢！
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sxxuan

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by wqj1988926 at 2011-02-25 11:19:16:
有可能是缓冲液的时间太久，我们实验室有人好像遇到过这样的问题

嗯，下次我会注意点的～
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你的日子如何，你的力量也必如何！
11楼2011-02-25 11:27:14
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woshishao

金虫 (初入文坛)

经验分享与讨论

★ ★ ★ ★
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silicare(金币+3): 鼓励新虫参与 2011-02-25 13:00:41
首先问楼主个问题，你的电泳跑时电压时多少？
然后对于楼主的PCR电泳图，我也出现过类似的情况。
经过个人总结，简称“涂布状条带”。
产生原因：1.PCR引物特异性不足，PCR扩增产生很多杂带，在电泳时如果使用大电压，  如120V,130V时PCR条带会跑的很宽，以至于和杂带连接成一片成涂布状。
解决方法：1.使用80V左右电压跑，你可以发现PCR条带都被压的很密集，非特异性扩增和目的条带分的很开，不管分析还是回收都可以说明了。不过为了数据漂亮，最好重设引物。

产生原因：2.凝胶没有凝好就跑电泳了，迁移率有问题，故出现上述情况。
解决方法：2.让凝胶凝集时间最好有20分钟-30分钟。

产生原因：3.模板污染，一般是污染了基因组DNA，导致相对引物特异性降低，扩增出很多条带。
解决方法：3。操作严谨，不要污染！个人觉得这个原因，一般注意了就不会出现。
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12楼2011-02-25 12:56:54
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silicare

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★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
换引物吧，是引物降解了
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13楼2011-02-25 13:00:50
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woshishao

金虫 (初入文坛)

补充

★ ★
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dhd997(金币+1): 鼓励交流 2011-02-25 14:06:23
还忘记问个问题了：你这个是不是融合PCR啊？我记得这种PCR很容易出现这个情况
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14楼2011-02-25 13:01:13
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sxxuan

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by woshishao at 2011-02-25 12:56:54:
首先问楼主个问题，你的电泳跑时电压时多少？
然后对于楼主的PCR电泳图，我也出现过类似的情况。
经过个人总结，简称“涂布状条带”。
产生原因：1.PCR引物特异性不足，PCR扩增产生很多杂带，在电泳时如果使用 ...

分析得很详细啊，谢谢！
跑电泳的电泳一般都是120V。
引物的特异性怎样这个问题就难了，因为已经换了好几对引物了。从12月做到现在一直都没有出来结果
操作的话，好像也没有特别不小心的地方。
至于其中一个模板确实是过年前就准备好的，放在-80度保存了好久
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你的日子如何，你的力量也必如何！
15楼2011-02-25 15:47:28
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sxxuan

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by woshishao at 2011-02-25 13:01:13:
还忘记问个问题了：你这个是不是融合PCR啊？我记得这种PCR很容易出现这个情况

什么是融合PCR？
我做的是先把两段序列分别扩增出来，然后再用中间引物把两段序列拼接在一起，成为一个序列
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你的日子如何，你的力量也必如何！
16楼2011-02-25 15:49:20
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sxxuan

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by silicare at 2011-02-25 13:00:50:
换引物吧，是引物降解了

引物是新合成的
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你的日子如何，你的力量也必如何！
17楼2011-02-25 15:49:58
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silicare

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引用回帖:
Originally posted by sxxuan at 2011-02-25 15:49:58:
引物是新合成的

谁说新合成就一定好了，引物合成之后是要纯化的，纯化不好的就出你这种smear
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18楼2011-02-25 17:46:10
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woshishao

金虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+6): good 2011-02-27 10:19:56
看图，这个就是融合PCR，你说你是把两个基因拼成已个基因，应该就是融合PCR了。这种PCR是这样的，引物特异性问题有点不好把握，容易出现这种情况。而且就算扩增出目的条带，也比较浅，建议使用80V来跑电泳，而且多PCR几管，有利切胶，楼主可以试下，希望有帮助~~~
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19楼2011-02-26 21:06:28
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angelia_cmx

金虫 (小有名气)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+1): 欢迎多来交流 2011-02-27 10:20:14
我读书时也做PCR，现在工作几年，忘光了，呵呵，心有余而力不足已。
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20楼2011-02-27 10:00:25
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