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sxxuan

金虫 (著名写手)

引用回帖:
Originally posted by wqj1988926 at 2011-02-25 11:19:16:
有可能是缓冲液的时间太久,我们实验室有人好像遇到过这样的问题

嗯,下次我会注意点的~
你的日子如何,你的力量也必如何!
11楼2011-02-25 11:27:14
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woshishao

金虫 (初入文坛)

经验分享与讨论

★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
silicare(金币+3): 鼓励新虫参与 2011-02-25 13:00:41
首先问楼主个问题,你的电泳跑时电压时多少?
然后对于楼主的PCR电泳图,我也出现过类似的情况。
经过个人总结,简称“涂布状条带”。
产生原因:1.PCR引物特异性不足,PCR扩增产生很多杂带,在电泳时如果使用大电压,  如120V,130V时PCR条带会跑的很宽,以至于和杂带连接成一片成涂布状。
解决方法:1.使用80V左右电压跑,你可以发现PCR条带都被压的很密集,非特异性扩增和目的条带分的很开,不管分析还是回收都可以说明了。不过为了数据漂亮,最好重设引物。

产生原因:2.凝胶没有凝好就跑电泳了,迁移率有问题,故出现上述情况。
解决方法:2.让凝胶凝集时间最好有20分钟-30分钟。

产生原因:3.模板污染,一般是污染了基因组DNA,导致相对引物特异性降低,扩增出很多条带。
解决方法:3。操作严谨,不要污染!个人觉得这个原因,一般注意了就不会出现。
12楼2011-02-25 12:56:54
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silicare

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小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
换引物吧,是引物降解了
13楼2011-02-25 13:00:50
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woshishao

金虫 (初入文坛)

补充

★ ★
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dhd997(金币+1): 鼓励交流 2011-02-25 14:06:23
还忘记问个问题了:你这个是不是融合PCR啊?我记得这种PCR很容易出现这个情况
14楼2011-02-25 13:01:13
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sxxuan

金虫 (著名写手)

引用回帖:
Originally posted by woshishao at 2011-02-25 12:56:54:
首先问楼主个问题,你的电泳跑时电压时多少?
然后对于楼主的PCR电泳图,我也出现过类似的情况。
经过个人总结,简称“涂布状条带”。
产生原因:1.PCR引物特异性不足,PCR扩增产生很多杂带,在电泳时如果使用 ...

分析得很详细啊,谢谢!
跑电泳的电泳一般都是120V。
引物的特异性怎样这个问题就难了,因为已经换了好几对引物了。从12月做到现在一直都没有出来结果
操作的话,好像也没有特别不小心的地方。
至于其中一个模板确实是过年前就准备好的,放在-80度保存了好久
你的日子如何,你的力量也必如何!
15楼2011-02-25 15:47:28
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sxxuan

金虫 (著名写手)

引用回帖:
Originally posted by woshishao at 2011-02-25 13:01:13:
还忘记问个问题了:你这个是不是融合PCR啊?我记得这种PCR很容易出现这个情况

什么是融合PCR?
我做的是先把两段序列分别扩增出来,然后再用中间引物把两段序列拼接在一起,成为一个序列
你的日子如何,你的力量也必如何!
16楼2011-02-25 15:49:20
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sxxuan

金虫 (著名写手)

引用回帖:
Originally posted by silicare at 2011-02-25 13:00:50:
换引物吧,是引物降解了

引物是新合成的
你的日子如何,你的力量也必如何!
17楼2011-02-25 15:49:58
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silicare

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小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by sxxuan at 2011-02-25 15:49:58:
引物是新合成的

谁说新合成就一定好了,引物合成之后是要纯化的,纯化不好的就出你这种smear
18楼2011-02-25 17:46:10
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woshishao

金虫 (初入文坛)

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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dhd997(金币+6): good 2011-02-27 10:19:56
看图,这个就是融合PCR,你说你是把两个基因拼成已个基因,应该就是融合PCR了。这种PCR是这样的,引物特异性问题有点不好把握,容易出现这种情况。而且就算扩增出目的条带,也比较浅,建议使用80V来跑电泳,而且多PCR几管,有利切胶,楼主可以试下,希望有帮助~~~

19楼2011-02-26 21:06:28
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angelia_cmx

金虫 (小有名气)

★ ★
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dhd997(金币+1): 欢迎多来交流 2011-02-27 10:20:14
我读书时也做PCR,现在工作几年,忘光了,呵呵,心有余而力不足已。
20楼2011-02-27 10:00:25
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