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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】为什么我的PCR产物总是连接不上T载体
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猫咪胖胖

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】为什么我的PCR产物总是连接不上T载体 已有21人参与

我PCR回收得到的片段，与T载体连接后转化摇菌提质粒后可以P出目的条带，但测序总显示是空载体，不知道怎么回事。
PMD-18T和T1-simple都试过。
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1楼 2011-02-13 22:23:25
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vs570588

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
我觉得菌落PCR挺准的，用M13引物，再选个小一点的Marker,我前几天做克隆，全空载，用菌落PCR，Marker2000，做有条带，测序说全空载，我自己换了DL500marker,再做菌落后跑胶，果然几乎所有条带都是在200以下，因为得目的条带要200，理论上条带应该在200到300。所以我决定重新做。大家说克隆最关键的一部是啥？
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25楼2011-03-20 20:29:36
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
恩，酶切验证最可靠。
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Thank-you，so-blue.
3楼2011-02-14 08:45:03
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amilie030312

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+5): 谢谢交流 2011-02-14 10:25:15
酶切一下，如果切不对，说明你前面酶切的酶有核酸外切酶活性，连接之前的那次酶切就少了几个碱基了，这可能是原因之一，用纯一点的酶。
另外，菌P能出结果不一定就是对的，PCR这东西很难说的，有一点点都能扩增出来，说明不了啥太多的问题。
还有可能是连接的时候手法操作有问题，换个人连接试试看，生物实验这东西有时候是挺邪门的，或者回去睡上三天大觉，回来就都出来了。
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4楼2011-02-14 09:59:41
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gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
PCR产物去测序啊，还能提高保密性，多好啊。。
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5楼2011-02-14 14:01:08
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