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lingluoying

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】DNA退火和磷酸化 已有2人参与

请问,如何合成了两端带酶切位点的四条单链DNA,其中两两是互补链,需要连在一起,再构建到载体上,应该怎么操作呢?我是采用互补链先各自退火(等体积混合,置于沸水中冷却到室温即可),再从中取等摩尔混合,用T4 PNK酶磷酸化处理后连接载体。但觉得有些问题,是不是操作有误?
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ben1147

木虫 (正式写手)

★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
amisking(金币+2): 鼓励发帖交流! 2011-01-21 19:34:42
退火了两次是什么意思?
就直接把互补的两条链等摩尔混合,沸水浴变性后缓慢冷却至室温就行了,然后可以直接和载体连接(如果载体是酶切的载体,没有去磷酸化的话,片段可以不用磷酸化)
2楼2011-01-21 19:13:21
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lingluoying

新虫 (初入文坛)

可问题是互补的两段各自退火后,只有互补链连起来了,前后两部分并没有连成长链呀,设计时中间一段是采用的一小段互补的序列的。
3楼2011-01-24 13:25:59
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