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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】电转化
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虫虫欲动

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】电转化

各位达人，我构建基因组表达文库时，想将连接产物电转到DH5a中，但加1ul连接产物时，转不出东西来，但加入3ul以上连接产物转化，就被打穿了，请做过相关研究的朋友指点迷津。
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1楼 2011-01-06 22:43:14
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gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)
★
最爱花诗雨(金币+1):鼓励一下 2011-01-07 09:10:18
虫虫欲动(金币+1): 2011-01-07 10:10:48
连接产物够多的话，过一次PCR纯化柱子，把buffer换成水

既然是做文库，对转化效率要求比较高，你1ul转不出来，3ul就能达到要求了吗?
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2楼2011-01-07 09:03:17
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susizheng

木虫 (著名写手)
★
最爱花诗雨(金币+1):有道理~~ 2011-01-07 09:12:19
虫虫欲动(金币+1): 2011-01-07 10:10:56
感受态细胞是怎么制备的？
我感觉应该还是感受态里面的离子浓度太高。连接产物那么一点，应该不会带入那么多离子的。
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3楼2011-01-07 09:04:46
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gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)
★
dhd997(金币+1):鼓励交流 2011-01-07 09:53:21
虫虫欲动(金币+1): 2011-01-07 10:11:02
需要做阳性对照，计算你感受态细胞的转化效率的，低于10e8效率就基本不能用来做文库了吧
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4楼2011-01-07 09:10:01
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jasco

木虫 (正式写手)
杯子被击穿是盐浓度过高导致的，如果你要加3ul连接产物，那么需要将连接产物沉淀后重新溶于dd水中
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5楼2011-01-07 10:34:43
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jasco

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2011-01-07 09:04:46:
感受态细胞是怎么制备的？
我感觉应该还是感受态里面的离子浓度太高。连接产物那么一点，应该不会带入那么多离子的。

如果是感受态制备的问题，加1ul的那个杯子也会打爆的吧
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6楼2011-01-07 10:36:10
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susizheng

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by jasco at 2011-01-07 10:36:10:


如果是感受态制备的问题，加1ul的那个杯子也会打爆的吧

我的意思是说，一般爆杯都是盐离子浓度过高导致的，而带入过多盐离子的应该是感受态，连接产物那点离子本来就少，加入感受态后又稀释了，影响不那么大。
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7楼2011-01-07 10:41:57
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gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)
连接产物不换buffer的话，其盐离子影响也是可观的，毕竟电转感受态细胞用的也不多。
楼主可以单加感受态细胞（不加连接产物）去电击一下看看 是多少ms
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8楼2011-01-07 15:02:56
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天使托

专家顾问 (职业作家)
★
rainwander(金币+1):http://bioinfbook.org/ 1st edition site PPT pdf 2011-01-07 21:04:34
这跟加入的质粒的量是没有关系的，只要比例合适就可以的~
转化爆了可能是你的感受态细胞里有气泡，或者转化管的问题。。。
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9楼2011-01-07 16:58:52
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