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nutplay

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】急!克隆快做了一个月了,就是做不出来 已有20人参与

TA 克隆
载体:pMD 18-T(Takara)
感受态:DH5a (天根)
实验流程是基本按照分子克隆上说的
PCR产物做了纯化,由于浓度比较低,所以
载体:0.5ul
PCR产物:4.5ul
Solution I: 5ul
14-16°连接过夜
转化用100ul的感受态细胞
热激什么的都没有问题,复苏后浓缩成100ul全部涂板,但是就是不长东西。做了阳性对照,也没长。好奇怪啊,不知道是哪里出了问题。
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nutplay

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
Originally posted by 小晓 at 2010-12-30 12:37:32:
你用什么酶做的PCR?确定末端有A吧?
主要就三个点关键:
1.感受态的效率,这个可以转个质粒看看,计算下效率有多高;
2.载体和片段质量,载体不要反复冻融,要不然末端被破坏了,保证载体浓度;回收的片段检测 ...

用taq酶~载体都是在冰上融的,而且换过新的,用了没几次
19楼2010-12-30 14:19:14
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
amisking(金币+2):鼓励 2010-12-28 19:42:26
先转个空质粒看看感受态是否有问题先。
如果感受态没问题,阳性对照都不长,应该要考虑盒子的问题了。
再就是你的片段多大?超过3K,pMD18-T连起来就有点难度了。

[ Last edited by susizheng on 2010-12-28 at 14:09 ]
Thank-you,so-blue.
2楼2010-12-28 14:08:49
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nutplay

新虫 (初入文坛)

片段1700多bp,正常大小,做了阳性对照的,还是没有长,换过好几个感受态了,以前用过人家做过能做出来的感受态也不长,崩溃啊~~~
3楼2010-12-28 14:18:43
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lhwei1987

铁杆木虫 (正式写手)

★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
rainwander(金币+1):鼓励积极参与~~~ 2011-01-01 00:57:10
连接时间可以加长试试,我上次一个2000的连接20小时才筛出来
4楼2010-12-28 15:26:09
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